222 из 221: Доступ ограничен: проблема с IP

  • 25.03.1981

Содержание

221 222 — Mercedes — OLX.uz

35 000 у.е.

Договорная

Ташкент, Учтепинский район 22 март

Ташкент, Яккасарайский район 16 март

Похожие запросы:

aBi+OMZ/rDETrvY2SlLVLnI4aqzvsBi7HBb2Web4U9/OfDlPUXwX/Sd7HdYhXCXjtPP/zdeJp5utkb0zAcf86HCaxdLM0d3Pri1STabHlW2qEcl1hWQi7Npq24OKxw7fyDiOUsbIBvioiyQLusKOlGl1DRHes0iaJ2IeosbAGUUi4PyrCxe/J/e8dGA/e42o+DEe3ZrdweWmcZX3AK/4H66cqytw5YWpcFxGjFabNWyy8U1Fki0e82d4Y8dLQztnxXt3RfPo6uj2L3DnuSMLyQ==

  • Недавно просмотренные
  • Избранные объявления (0)
  • Избранные результаты поиска

Mercedes S-Klasse (W222, W221, W220, W140)

Самый новый, самый представительный, вообщем самый самый … S-класс W221 оказался очень комфортным и не шибко надежным в части трансмиссии. Случаются поломки и на … 50 000 км, ещё в 2006 году у дилеров скапливалось множество гарантийных узлов. На всех бензиновых S350 S400 Hybrid S450 S500 S550 S600 S63AMG и турбодизельных S320 S420 модификациях ставилась 722.9 (в последствии 7G-Tronic, 7G-Tronic+) 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 г.в.

Несмотря на все преимущества 722.9, трансмиссия показала себя не с очень надежной стороны. Проблемы с 722.9 легко могут начаться с 50 000 км (обычно в диапазоне 50-150 т.км). К верхней границе диапазона она ломается практически у 95% автовладельцев (ресурс с завода сделали именно таким). Качество изготовления деталей значительно снизилось по сравнению с предыдущими сериями.

В большинстве случаев родоначальником поломок акпп Мерседес 722.9 является электронный блок управления коробкой (находится в гидроблоке). Как правило клиенты приезжают с симптомами дергания и вялым стартом с места (кпп находится в аварийном режиме). В зависимости от конкретной ситуации решением является замена платы управления на новый либо замена в сборе с гидроблоком, но уже давно мы практикуем решение по ремонту этой платы (оно дешевле).

Далее следует обязательная привязка платы управления и адаптация.

Если состояние коробки передач Мерседес плачевное (к примеру весь в поддон в стружке, значит есть внутреннее повреждение механической части), то скорее всего понадобится капитальный ремонт акпп Мерседес W221, который приблизительно будет включать в себя: ремонт гидротрансформатора, гидроблока, эбу акпп, замена масляного насоса, к-барабана, масла, фильтра, ремкомплекта. Прописка и адаптация. В некоторых случаях бывает поврежден корпус КПП.

ПРИМЕРЫ ПОСЛЕДНИХ РАБОТ W221

Это поколение представительского S-класса имело индекс W220 и выпускалось в 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 годах, комплектовалось бензиновыми S280 S320 S350 S430 S500 S55AMG S600 S65AMG и дизельными CDI S320 S400 агрегатами. Все оснащались 5-ти ступенчатыми автоматами собственного производства 722.6. Трансмиссия достаточно надёжная и проверенная временем.

Типичные неисправности акпп 722.6 довольно стандартны и включают в себя: внутренее разрушение гидротрансформатора, некорректная работа блока управления коробкой 722. 6, разрушение планетарных рядов, забитый стружкой гидроблок как всё вместе так и по отдельности (это уж как повезет). Обычно при самом запущенном состоянии агрегата ремонт акпп Мерседес w220 состоит из следующих работ и оригинальных запасных частей: замена планетарных рядов, полный ремкомплект (прокладок, фрикционов, сталей и т.д.), обязательного ремонта гидротрансформатора, замена масляного насоса на новый, восстановление корректной работы гидроблока и эбу акпп, и, стандартные, замена масла и фильтра.

На легенду девяностых W140 S300SE S300SEL (140.032) S280 (S124.028) S300TD (140.135) S350TD (140.134) S420 (140.042) S500 (140.050 140.051) S600 (140.056 140.057) ставились 4-х ступенчатый автомат 722.3 и 5-ти ступенчатый 722.6, выпускались в 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 годах. Оба агрегата очень надежны, но к 300 000 км практически все вырабатывают свой, заложенный с завода, ресурс. Следует отметить что под одной серией 722.3, да и 722.6 скрывается несколько видов коробок различающихся внутри для, к примеру, большеобъемных моментных двигателей 6л.

По 722.3 коробке уже изучено всё вдоль и поперек, по 722.6 смотрите в разделе W220.

101 102 103 104 015 221 222 223 керамический конденсатор

101 102 103 104 015 221 222 223 керамический конденсатор
Название продукта 101 102 103 104 015 221 222 223 керамический конденсатор
Материал Керамические
Номинальное напряжение 1KV-50КВ
Клемма Провода отведений
Терпимости 5% J, 10%K, 20% М
Повышенная рабочая температура   -25°C~+85 °C
Размер   Малых


 

  Эта функция  Керамического конденсатора

♦подходит для точной настройки контура
♦подходит для цепей, чтобы компенсировать воздействие температуры

Применение  Керамический конденсатор

♦подходит  Для  Питания    Цепи    Подавления шума  Цепи    Электронного  Оборудования
♦может  Быть  Использован  В качестве  Антенны  Муфту с  Перекрестными соединениями  И  Байпасный  Контур

Городе Tianrui Electronics Co., Ltd — один из самых профессиональных цепи защиты компонентов производителей и программы поставщиков в Китае около 10 лет. Наша продукция широко используется для домашних хозяйств и промышленности. Наша команда будет служить для вас с самого начала в качестве источника до самого конца на перевозку. Мы экспортера на заводе, с тем чтобы расходы могут быть сохранены непосредственно для вас.

Часто задаваемые вопросы об держателя предохранителя:

Q1. Каковы ваши условия упаковки?

A: В целом мы упаковываем наших товаров в нейтральное положение коробки и коробок коричневого цвета. Если у вас есть юридически зарегистрированных патентов,   Мы можем упаковка товаров в вашей торговой маркой ящики после получения Вашего письма авторизации.

Q2. Каковы ваши условия платежа?

A: T/T 50 % в качестве залога, и 50% перед поставкой. Мы покажем вам фотографии продуктов и пакетов  До оплаты.

Q3. Каковы ваши условия поставки?

A: EXW, ФОБ, CFR и CIF, DDU.

Q4. Как узнать о вашем срок поставки?

А: Как правило,   3-7 дней после получения вашего авансового платежа. Конкретный срок поставки зависит от  По этим пунктам и количество заказа.

Почему мы?

1. Контроль качества: Все продукты будут проходить через множество испытаний осторожно перед отправкой заказчику.

2. Производственная мощность конкуренции и быстро.

3. Manufactuer цена: На заводе прямой продажи, наиболее конкурентоспособной цене.

4. Малые с приемлемым.

2.

СВЕДЕНИЯ О РАСПРЕДЕЛЕНИИ ЧИСЛА ПОСТРАДАВШИХ ПРИ НЕСЧАСТНЫХ СЛУЧАЯХ НА ПРОИЗВОДСТВЕ ПО ОСНОВНЫМ ВИДАМ ПРОИСШЕСТВИЙ И ПРИЧИНАМ НЕСЧАСТНЫХ СЛУЧАЕВ / КонсультантПлюс

Наименование показателя

N строки

Число пострадавших с утратой трудоспособности на 1 рабочий день и более и со смертельным исходом, чел.

всего

из них со смертельным исходом

1

2

3

4

Всего пострадавших (сумма строк 211, 213, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 228, 229;

сумма строк 230, 231, 232, 233, 234, 235, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246)

210

Из общего числа (стр. 210) — пострадавшие по основным видам происшествий, приведших к несчастному случаю:

в том числе при наездах транспорта на работника

212

Падение пострадавшего

213

в том числе:

при гололеде на обслуживаемом участке

214

с высоты (опоры, лестницы, стремянки, крыши и т.д.)

215

Падения, обрушения, обвалы предметов, материалов, земли и т.п.

216

Воздействие движущихся, разлетающихся, вращающихся предметов и деталей

217

Воздействие экстремальных температур

219

Воздействие вредных веществ

220

Воздействие ионизирующих излучений

221

Физические перегрузки

222

Повреждения в результате контакта с животными, растениями, насекомыми и пресмыкающимися

223

Утопление или погружение в воду

224

Убийство или травмы, нанесенные другим лицом

225

убийство с целью ограбления

226

разбойное нападение с целью ограбления

227

Повреждение при стихийных бедствиях и чрезвычайных ситуациях

228

Прочие

229

Из общего числа (стр. 210) — пострадавшие по причинам несчастных случаев:

Конструктивные недостатки, несовершенство, недостаточная надежность машин, механизмов, оборудования

230

Эксплуатация неисправных машин, механизмов, оборудования

231

Нарушение технологического процесса

233

Нарушение требований безопасности при эксплуатации транспортных средств

234

Нарушение правил дорожного движения

235

в том числе:

водителем стороннего автотранспорта

236

водителем собственной организации

237

Неудовлетворительная организация производства работ

238

Неудовлетворительное техническое состояние зданий, сооружений, территории

240

Недостатки в обучении безопасным приемам труда

241

Неприменение средств индивидуальной защиты

242

Неприменение средств коллективной защиты

243

Нарушение трудовой и производственной дисциплины

244

Использование рабочего не по специальности

245

в том числе:

личная неосторожность

247

неудовлетворительное содержание животных, имеющих хозяев

248

противоправные действия сторонних лиц

249

Контрольная сумма строк с 210 по 249

299

Чем отличается Ваго 221 от 222? – СидмартинБио

Чем отличается Ваго 221 от 222?

Новые соединители проводки Wago серии 221 на 40 % меньше, чем соединители серии 222, что помогает дополнительно уменьшить пространство внутри распределительных коробок. Компактная конструкция без использования инструментов — отличный способ подключения кабелей. Они подходят для использования с многожильными и одножильными кабелями и идеально подходят для использования в домашней или промышленной электропроводке.

Что такое ваго-блок?

Компактные клеммные колодки WAGO

для монтажа на рейку чрезвычайно компактны, что делает их идеальными для приложений с ограниченным пространством.Проверенная временем технология CAGE CLAMP® от WAGO обеспечивает надежное соединение.

На что рассчитаны вагоны?

Номинальное значение этого компактного разъема: 400 В, 32 А. Соединители MICRO PushWire серии WAGO 243 предназначены для небольших одножильных проводников диаметром от 0,6 мм до 0,8 мм. Доступны модели с 4 или 8 контактами в четырех различных цветах, они очень компактны, но просты в использовании.

Для чего используются вагоны?

Соединители Wago

были разработаны для облегчения процесса сращивания без использования инструментов.Технология хлопков Wago ускоряет установку и устраняет потребность в техническом обслуживании. Все они используют зажимы для концевой заделки тонкожильных и одножильных проводников.

Должен ли Ваго быть в коробке?

WAGOBOX® Light В соответствии со стандартом BS 7671 «каждое соединение и окончание должны быть закрыты, независимо от номинального напряжения».

Wago не требует обслуживания?

Разъемы

Wago НЕ требуют технического обслуживания. Только вся сборка может быть необслуживаемой. При использовании соединителей Wago ЕДИНСТВЕННЫЙ способ добиться соединения, не требующего технического обслуживания, — это заключить соответствующие соединители Wago в Wagobox.

Можете ли вы последовательно вставить разъемы проводов?

Гирлянда То же, что и для соединения жгутов проводов косичками. Это не проблема, если вы не превышаете заполнение проводника отдельного разъема или не перегружаете коробку.

Является ли Wago 221 многоразовым?

Соединители

провод-провод, Wago 222 и 221, обладают целым рядом преимуществ. В отличие от вставных соединителей, соединители Wago можно использовать для одножильных, многожильных и тонкожильных проводов или проводников, а также использовать их повторно.

Когда вышел Wago 221?

2015
В 2015 году была выпущена 221 серия. Серия 221 аналогична серии 222, но тоньше и имеет прозрачный корпус, что позволяет проверить правильность ввода провода.

Ваго хороши?

Наш инструктор по электротехнике утверждает, что «разъемы Wago, вероятно, являются одним из лучших достижений в области электромонтажа», с которыми он столкнулся. «Это на 100 % лучше, чем старые распределительные коробки с винтовыми соединениями, которые были основным компонентом электроустановочной отрасли.

Какие патроны использует Remington 222?

Большинство заводских комплектов калибра .222 содержат пули весом 50 гран со скоростью 3140 футов в секунду из испытательных стволов диаметром 24 дюйма. Как правило, спортивные винтовки под патрон .222 имеют более короткие 22 дюйма и теряют около 70 кадров в секунду. Все боеприпасы заводского производства предназначены для варминтов с упором на полное разрушение снаряда сразу после удара.

Какой раневой канал у Remington 222?

С обычными снарядами, включая все заводские боеприпасы, калибр .222 на близких и средних дистанциях образует широкий раневой канал, однако широкая рана быстро сужается по мере потери энергии в пределах 5-6 дюймов от пробития. За пределами этой глубины раневой канал имеет тенденцию быть очень узким.

Когда был изготовлен патрон Remington.222 Varmint?

Впервые представленный Remington в 1950 году, патрон .222 Remington был разработан в первую очередь как патрон для варминта. В то же время зарождалась стрельба из бенчреста.

Какова максимальная начальная скорость Remington 222?

H-322, BLC-2 и 4895 обычно хорошо работают в .222. Для спортивной винтовки с 22 стволами реалистичная безопасная максимальная рабочая скорость включает 3380 кадров в секунду со снарядами 40 гран, 3180 кадров в секунду со снарядами 50 гран, 3130 кадров в секунду с использованием снарядов от 52 до 55 гран и 2930 кадров в секунду со снарядами 60 гран.

Роль миР-221/222 в развитии опухоли и лежащий в ее основе механизм

МикроРНК-221/222 (миРНК-221/222, миР-221/222) представляет собой некодирующую микроРНК, которая широко распространена в эукариотических организмах и глубоко вовлечена в посттранскрипционная регуляция экспрессии генов.Согласно последним исследованиям, аномальная экспрессия miR-221/222 тесно связана с возникновением и развитием различных видов злокачественных опухолей. Роль миР-221/222 в развитии опухоли и их потенциальный молекулярный механизм при различных видах рака, включая рак печени, колоректальный рак, рак шейки матки, рак яичников и карциному эндометрия, обобщены и рассмотрены в этой статье. Кроме того, также обсуждается потенциальная роль трансляционного биомаркера аномального уровня миР-221/222 в опухоли или кровообращении для диагностики опухоли.

1. Введение

МикроРНК (миРНК) — это короткие эндогенные некодирующие РНК длиной 18–25 нуклеотидов. В геноме человека закодировано несколько тысяч микроРНК, которые регулируют более 30% генов, тем самым участвуя в регуляции практически всех клеточных функций, таких как клеточная дифференцировка, пролиферация, рост, миграция и апоптоз. Как показано, микроРНК-221/222 (миРНК-221/222, миР-221/222) представляет собой некодирующую микроРНК, которая широко распространена в эукариотических организмах и глубоко вовлечена в посттранскрипционную регуляцию экспрессии генов [1-4].

Hsa-miR-221 и hsa-miR-222 кодируются тандемно в хромосоме Xp11.3, которые представляют собой высоко гомологичные микроРНК, имеющие одну и ту же «исходную последовательность». В настоящем исследовании изучалась роль миР-221/222, которая играет важную регулирующую роль в развитии и прогрессировании опухолей, как в стимуляции, так и в подавлении рака [5]. Поскольку существуют разные подтипы, такие как miR-221/222 3p или 5p, гетерогенность которых может выполнять разные биологические функции, их новые достижения также рассматриваются в этой статье. Биогенез миР-221/222 аналогичен биогенезу других миРНК, который первоначально транскрибируется в основном либо РНК-полимеразой II, либо РНК-полимеразой III в виде длинных первичных транскрипций, а затем обрабатывается ядерной РНКазой Drosha и цитоплазматической РНКазой Dicer с образованием предшественника. микроРНК и зрелые микроРНК соответственно (рис. 1) [6]. В цитоплазме miRNAs распознают и связываются с частично комплементарными сайтами в 3′-нетранслируемой области (3’UTR) мРНК-мишеней, что приводит либо к репрессии трансляции, либо к деградации мишени [7].


Недавно накопленные исследования показали, что аномальная экспрессия миР-221/222 участвует в возникновении и прогрессировании различных опухолей. Как уже отмечалось, аномальная экспрессия miR-221/222 способствует пролиферации, инвазии и метастазированию раковых клеток, повышению стволовости, выживанию клеток, химиорезистентности или рецидиву раковых клеток [5, 8]. В этом обзоре обобщаются и обсуждаются роль и ход исследований потенциального механизма миР-221/222 в развитии опухоли.

2. Роль миР-221/222 в онкогенезе и прогрессировании
2.1. Восходящая регуляция miR-221/222

В последние годы исследования показали, что в биогенезе miRNA (рис. 1) шпильки pri-miRNA Дроши и Дайсера могут приводить к изменению длины 5′- или 3 ‘-конец микроРНК [9]. Таким образом, изоформа микроРНК длиннее или короче консенсусной длины микроРНК [10]. Неоднородность на 5′-конце может приводить к «затравочным сдвигам», тем самым изменяя ожидаемый пул генов-мишеней [11], в то время как 5′-вариация встречается относительно редко.Напротив, 3’-неоднородность обнаруживается как более распространенная ситуация [12–14]. Другие исследователи предположили, что эндонуклеаза, необходимая для производства зрелых miRNAs, связана с регуляцией miR-222. Уэда и др. сообщили [15], что клетки, разрушенные Dicer, демонстрируют повышенную экспрессию молекулы межклеточной адгезии-1 ( ICAM-1 ) и повышенную восприимчивость к CTL-опосредованному цитолизу, и прямо продемонстрировали, что miR-222 функционально нацелена на 3′-UTR ICAM- 1 мРНК в соответствии с репортерным анализом люциферазы. После трансфекции миРНК Dicer или ингибиторами миР-222 результаты проточного цитометрического анализа и иммуноблотинга показали, что ингибирование Dicer или миР-222 приводило к увеличению экспрессии ICAM-1 в клетках злокачественной глиомы человека и повышало их чувствительность. к цитотоксическим Т-лимфоцитам (ЦТЛ). Чжан и др. предположили, что аденозиндеаминазы, действующие на РНК (ADAR) 1, могут способствовать экспрессии миРНК-222 путем образования комплекса с Dicer, а экспрессия белка фосфатазы-и-тензина (PTEN) была значительно снижена с помощью миРНК-222-мишени гена PTEN 3′. УТР [16].Чен и др. обнаружили, что экспрессия Dicer была значительно увеличена в клеточной линии PC9/GR устойчивого к гефитинибу немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) по сравнению с гефитиниб-чувствительной линией клеток NSCLC PC9, в то время как молчащий Dicer индуцировал чувствительность к гефитинибу в клетках NSCLC через подавление миР-221/222 для повышения уровня белка каспазы-3 [17]. Кокрейн и соавт. обнаружили, что миР-221/222 была выше в отрицательных по рецептору эстрогена 1 (ESR1) клеточных линиях рака молочной железы, чем в положительных клеточных линиях рака молочной железы, и миР-221/222 напрямую нацелены на Dicer и ESR1 [18].

Цитокины играют ключевую регуляторную роль в экспрессии подтипов миР-221/222 (рис. 2). Человеческая полинуклеотидная фосфорилаза ( hPNPaseold-35 ), высокоэволюционно консервативный ген, который катализирует 3′-5′-фосфоролиз, а также 5′-3′-полимеризацию РНК, действует как тример в экспрессии miR- 221/222 подтипа. Дас и др. [19] сообщили, что сверхэкспрессия hPNPaseold-35 при лечении IFN типа I приводила к надежному и предпочтительно направленному подавлению микроРНК-221/222 с последующим усилением ее подавленного целевого ингибитора циклинзависимой киназы p27 Kip1 .Неджад и др. обнаружили, что стимуляция IFN типа I избирательно снижает уровни более длинных изоформ miR-221-3p и miR-222-3p, сохраняя при этом более короткие [20]. Ю и др. [21] проанализировали вариации эндогенной длины в образцах опухоли рака молочной железы и наблюдали частое появление матричных 3′-изомиР микроРНК-221/222. В клеточной линии рака молочной железы MCF10A более длинная миР-222 (удлиняющая 2–4 нуклеотида на 3′-конце) снижает слияние клеток и способствует клеточному апоптозу за счет подавления PI3K-AKT, а более длинная миР-222 проявляет повышенную склонность к ядерной локализации. , что указывает на то, что разные подтипы микроРНК могут иметь разные функции.И когда эти подтипы регулируются, это также влияет на клеточную активность. Паннерсельвам и др. [22] обнаружили, что IL-24 может снижать уровни miR-222-3p и -5p, тем самым повышая целевой уровень PPP2R2A miR-222, ингибируя активацию протеинкиназы B (PKB, AKT) и ингибируя экспрессию AKT в клетках рака легкого. Lodge сообщил [23], что цитокин TNF- α , продуцируемый макрофагами, может усиливать экспрессию miR-221/222 и что miR-221/222 связывается с мРНК CD4 .Также было обнаружено, что цитокины не только регулируют экспрессию miR-221/222, но и избирательно снижают уровень аллогенных клеток, чтобы реализовать регуляцию клеточной активности.


2.2. Регуляция конкурирующих эндогенных РНК на miR-221/222

Предположение о конкурирующих эндогенных РНК (сеРНК) было основано на серии исследований «разговоров» между РНК [24]. Они представляют гипотезу о кРНК как о том, что обращенные РНК влияют на уровни друг друга, конкурируя за ограниченный пул микроРНК, который по существу относится к «РНК ⟶ миРНК», а также является дополнением к традиционной теории «миРНК⟶РНК».В контексте рака псевдогены и длинные некодирующие РНК (IncRNAs) могут действовать как потенциальные опухолевые супрессоры и онкогены благодаря своей функции ceRNA путем связывания ответных элементов miRNA (MRE). Лу и др. использовали идентификацию ceRNA на основе молекулярной сети (MNIceRNA) для построения сетей miRNA-mRNA-IncRNA при карциноме щитовидной железы, в то время как hsa-miR-221/222 выступали в качестве ключевых драйверных РНК во время процесса [25]. Лю и др. подтвердили, что экспрессия IncRNA GAS5 была значительно ниже в клеточных линиях HCT116 и SW480 по сравнению с таковой в нормальной клеточной линии NCM460, тогда как экспрессия miR-222-3p была значительно выше [26]. Двойной репортерный анализ люциферазы, иммунопреципитация РНК (IP) и анализ РНК-пулл-даун показали, что miR-222-3p может специфически связываться с PTEN и IncRNA GAS5, и предположили, что IncRNA GAS5 может регулировать PTEN путем конкурентного связывания с miR-222-3p. 3р.

2.3. Мишени miR-221/222 и пути молекулярной модуляции

PTEN , TIMP3 (тканевой ингибитор металлопротеиназ 3), p27 и p57 часто являются хорошо известными дисрегуляциями генов-супрессоров опухолей, но рак человека [27].Исследование показало, что как miR-221, так и miR-222 непосредственно нацелены на 3’UTR мРНК p27 и p57 и снижают уровень белка p27 и p57 , таким образом активируя путь AKT [28]. С другой стороны, miR-221 и miR-222 также нацелены на PTEN и вызывают толерантность к TRAIL и усиливают миграцию клеток [29]. PUMA является членом семейства белков Bcl-2 и оказывает сильное проапоптотическое действие [30], в то время как miR-221/222 может связываться с 3’UTR мРНК PUMA , ингибируя экспрессию PUMA , а затем сопротивляться нормальному апоптозу. [31] (табл. 1).

[31] [35] [35] [35] [35] [35]

1

PTEN , MST3 , MIA3

6

, BMF , ,

Роли в раке типы Раковые MIR-221/222 Целевые гены Список литературы

Онко-микроРНК глиобластомы Оба PUMA [31]

7

MIR-222 Reck , Hipk2 [32, 33]
PTEN [34]
Рак мочевого пузыря MIR-222 PPP2R2A

7

MIR-222 SOCS3 , PPP2R2A

6

[36, 37 % HDAC6 , ADIPOR1 , ERα , ERα , CASPASE 3 , SOCS3 [38-46]
MIR-222 PPP2R2A , GNAI3 , BBC3 , PBX3 [47-50] [47-50] [47-50]
pten , pten , p27 , p27 [29, 51]
Colorectal Cancer MIR-221 P27 , P57 , PTEN , TP53INP1 , Reck

6

[49, 52, 53]
MIR-222 [54 -56]
и P27 , P57 , pten , pdlim2 , pdlim2 [57, 58]
Рак молочной железы MIR-221 A20 [59]

6

ERα , MYBL1 , MYBL1 , CDKN1B , BIM , CDKN1C , PTEN1C , PTEN , TIMP3 , DDIT4 [60- 63]
рак шейки матки MIR-221 Vash2 , THBS

6

[64, 66]
MIR-222 P27 , PTEN [67]

6

TIMP3 [68]

7

IR-221 MIR-221 [69, 70]
MIR-222 P27 , SOCS3 , GNAI2 , GNAI2 [71, 72]
P57 , PTEN

6

[66, 73]
Эндометрия Carcino MA MO MIR-222 ERα [74]

7

P27 , C Kit

6

[75, 76]
Рак поджелудочной железы MIR-222 MIR-222 P27 P27 [77]

1

pttr , pten [78-79]
Множество миелома 221 p27Kip1 [80]
Хронический лимфолейкоз И р27 [81]
Оральный карциномы И р27 [82]
Ретинобластома Оба ap2α [83]
Рак носоглотки 6-14222 miR 6 6 6 PTEN [84]
карциномы простаты И р27 [85]

опухолевый супрессор микроРНК Рак простаты И ecm29 [61]
эритролейкоз И комплект [86]
Желудочно-кишечные стромальные опухоли И комплект [87]
Язык плоскоклеточный рак микроРНК-222 ММР1 , SOD2 [88]
Холангиокарцинома микроРНК-221 pik3r1 [89]
рак яичников миР-221 арф 4 [90]
миР-222 gnai 2 [91]
рак ободочной микроРНК-222 адам-17 [92]
Медуллобластома микроРНК-221 eif5a2 [93]

2.
4. Дисрегуляция миР-221/222 при раке человека

Аномально высокая экспрессия миР-221/222 вовлечена в различные виды рака (таблица 1), что способствует злокачественной пролиферации, иммунному ускользанию, инвазии и метастазированию опухолевых клеток [ 94]. Благодаря поиску и статистике баз данных (включая PubMed и Web of Science) онкоген активировался с гиперэкспрессией миР-221/222, включая глиобластому [31], рак желудка [32, 33], рак мочевого пузыря [35], гепатоцеллюлярный рак [38, 39, 51, 59], рак легкого [36, 37], рак печени [29, 51], рак молочной железы [60–63], рак шейки матки [64, 68, 95], рак яичников [66, 69, 70], карцинома эндометрия [74], меланома [75, 76], рак поджелудочной железы [77], рак щитовидной железы [78, 79], множественная миелома [80], хронический лимфоцитарный лейкоз [79], карцинома полости рта [82] , ретинобластому [83, 96], рак носоглотки [84] и рак предстательной железы [85].Однако активация миР-221/222, также называемая миРНК-супрессором опухоли, нацеленная на сверхэкспрессирующие онкогены, приводит к подавлению опухоли. Например, кластер miR-221/222 непосредственно нацелен на Ecm29 и ослабляет миграцию и инвазию в клетки PCa при раке предстательной железы [61]. miRNA-221/222 также нацеливается на kit + в эритролейкемических клетках [86] и патогенезе гастроинтестинальной стромальной опухоли [87], чтобы ингибировать пролиферацию клеток и индуцировать апоптоз. Функциональный анализ и анализ репортерного гена люциферазы показали, что has-miR-222 ингибирует инвазию клеток плоскоклеточной карциномы языка полости рта путем нацеливания на мРНК матриксной металлопротеиназы 1 ( MMP1 ) и супероксиддисмутазы марганца 2 ( SOD2 ) [88].Кроме того, в исследовании клеток холангиокарциномы человека Huh38 Окамото и его коллеги обнаружили, что miR-221 может нацеливаться на фосфоинозитид-3-киназу, регуляторную субъединицу 1 ( PIK3R1 ), для ингибирования пролиферации клеток Huh38 и придания чувствительности к Gem [89].

3. Роль миР-221/222 в различных видах рака
3.
1. Роль миР-221/222 в развитии рака печени

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) — одна из наиболее летальных злокачественных опухолей [97]. Недавно Сонг и др. [98] несколько лет назад опубликовали обзор о влиянии сверхэкспрессии miR-221/222 на рак печени, сосредоточив внимание на взаимосвязи между сверхэкспрессией miR-221 и ГЦР, в то время как более подробная информация между miR-221 и -222 и ГЦК сообщается. в недавних работах [38, 79, 90, 91, 99].В нескольких работах показано, что уровень miR-221/222 связан со стадиями опухоли по TNM [39, 100, 101], среди которых Fu et al. обнаружили, что miR-221 в первую очередь локализуется в плазме [102]. Ли и др. [103] обнаружили, что уровни miR-221/222 были выше у пациентов с ГЦР, а общая выживаемость в группе с высокой экспрессией miR-221 была значительно ниже, чем в группе с низкой экспрессией miR-221, согласно анализу 46 HCC. пациентов и 20 здоровых нормальных контролей с помощью ОТ-ПЦР. Сон и др. [104] исследовали уровни сывороточных экзосомальных микроРНК у пациентов с ГЦК и сравнивали их с уровнями, наблюдаемыми у пациентов с хроническим гепатитом В (ХГВ) или циррозом печени (ЦП). В результате уровни сывороточных экзосомальных миР-221 и миР-222 были значительно выше у пациентов с ГЦК, чем у пациентов с ХГВ или РЛ.

Было показано, что PTEN, TIMP3 и p27/CDKN1B идентифицируются как мишени miR-221/222 в образцах ГЦК [29, 51]; таким образом, переход G1/S представляет собой потерю контроля в HCC. Грамантьери и его коллеги [41] использовали три алгоритма прогнозирования (miRanda, TargetScould и PicTar), которые предсказали, а репортерный анализ люциферазы подтвердил, что недостаточность костного мозга (BMF), проапоптотический Bh4-только член семейства Bcl-2, является мишенью miR. -221 [105].Недавние сообщения показали, что miR-222 нацелена на 3’UTR мРНК B-клеточной лимфомы-2, связывающей компонент 3 (BBC3) в клеточной линии HepG2 [48]. Вонг и др. [39] предположили, что передача сигналов AKT является основным путем, на который влияет miR-222, и что PPP2R2A является мишенью miR-222 in silico, тем самым усиливая инвазию и подвижность клеток HCC. Пино и др. [51] наблюдаемая экспрессия miR-221 может отличать злокачественные ткани от соседних цирротических тканей и идентифицировать индуцируемый повреждением ДНК транскрипт 4 (DDIT4) как прямую мишень miR-221. Эктопическая сверхэкспрессия гистондеацетилазы 6 (HDAC6) вызывает активацию JNK/c-Jun, приводящую к аутофагической гибели клеток HCC [106]. Бэ и др. [42] обнаружили, что miR-221 увеличивалась в соответствии с активированным Met/JNK c-Jun и индуцированной цитокинами активацией фактора транскрипции NF- κ Bp65, в то время как miR-221 подавляла HDAC6 и, таким образом, способствовала злокачественной трансформации и пролиферации гепатоцеллюлярных клеток. . Чжан и др. [47] обнаружили, что полипептид 3 с альфа-ингибирующей активностью (GNAI3) ингибирует миграцию и инвазию клеток HCC, но GNAI3 подавляется при HCC на уровне белка, но не на уровне мРНК.Они также идентифицируют, что миР-222 напрямую связывается с 3’UTR GNAI3 и посттранскрипционно регулирует экспрессию GNAI3. Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) увеличивает миграционную способность эпителиальных клеток и играет ключевую роль в метастазировании раковых клеток [105]; в некоторых сообщениях показано, что miR-221 способствует EMT в клеточных линиях HCC путем нацеливания на адипонектиновый рецептор 1 (AdipoR1) и передачу сигналов цитокинов 3 (SOCS3), что подразумевает, что может быть задействован сигнальный путь JAK/STAT3 [44, 45]. Белок вируса гепатита В Х (НВх) играет важную роль в развитии гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК).Чен и др. [46] определили, что miR-221 способствует пролиферации раковых клеток HCC, связанных с HBV, путем прямого нацеливания на рецептор 1 эстрогена (ER α ).

миР-221/222 действует не только как биомаркер у пациентов с ГЦК, но также непосредственно нацеливается на ключевые мишени при раке печени (рис. 3). Форнари и др. [43] продемонстрировали, что каспаза-3 является прямой мишенью миР-221 при ГЦР, что также предполагает ингибирование миР-221 в качестве терапевтического подхода, направленного на контрастную резистентность к сорафенибу. Более того, роли miRNAs зависят от клеточного контекста.Например, Хан и др. [50] подтвердили, что α 2 δ 1 (кодируется геном CACNA2D1 ) является поверхностным маркером, который маркирует клетки, инициирующие опухоль ГЦК (TIC), и они идентифицировали миР-222 как супрессор опухоли при ГЦК с помощью контроль стволовости и туморогенности α 2 δ 1 + TIC путем прямого нацеливания на гомеобокс 3 пре-В-клеточного лейкоза (PBX3), который активировал экспрессию CACNA2D1 .


3.2.Роль миР-221/222 в колоректальном раке

Колоректальный рак (КРР) является одним из наиболее распространенных видов рака и пятой по частоте причиной смерти от рака во всем мире [97]. В нескольких сообщениях показано, что уровни миР-221/222 повышены в CRC человека [58]. Раннее эффективное выявление имеет решающее значение для профилактики заболеваний; однако CRC протекает бессимптомно на ранней стадии, и его трудно диагностировать до поздних стадий. Таким образом, существует острая необходимость в идентификации молекулярных биомаркеров для массового скрининга и ранней диагностики CRC.Отчет показал, что количество миР-221 () было значительно выше в периферической крови 71 пациента с колоректальным раком по сравнению с 80 здоровыми людьми из контрольной группы [107]. Яу и его коллеги оценили уровень miR-221 в плазме [108] и уровень miR-221 в кале [109] и обнаружили, что miR-221 в плазме обладает высокой чувствительностью (86%), но низкой специфичностью (41%), а AUC составляет всего 0,61. Напротив, миР-221 в кале имела AUC 0,73, уровень чувствительности 62% и уровень специфичности 74%; следовательно, обнаружение миР-221 в стуле является лучшим способом.Есть несколько сообщений, в которых изучались изменения miR-221/222 в циркулирующих опухолевых клетках (CTC) и miRNAs из CTC во время лечения CRC, и было обнаружено, что изменения количества отражают прогрессирование заболевания и / или ответ на химиотерапию; однако уровни miRNA (включая miR-221/222) из ​​CTC показали временную экспрессию и не коррелировали с количеством CTC [110].

Онкоген KRAS индуцирует повышенную экспрессию miR-221/222 в клеточных линиях CRC человека [111]. Показано, что p27/ CDKN1B , p57/ CDKN1C и PTEN идентифицированы как мишени miR-221/222 в клетках CRC [49, 53, 54, 57].Ляо и др. [52] продемонстрировали, что miR-221 способствует клеточной пролиферации CRC посредством ингибирования аутофагии и индуцированного целевым опухолевым белком 53 ядерного белка 1 (TP53INP1). Лю и др. [58] предложили петлю положительной обратной связи miR-221/222-NF- κ B-STAT3 в развитии и прогрессировании CRC человека. Они продемонстрировали, что miR-221/222 регулирует передачу сигналов NF- κ B и STAT3 путем прямого связывания с кодирующей областью rela и стабилизации мРНК rela . Кроме того, миР-221/222 активирует как белок RelA, так и белок STAT3 посредством связывания с 3’UTR PDLIM2 в качестве лигазы E3 как для RelA, так и для STAT3.

Основной причиной смерти от КРР является метастазирование и реверсия (рис. 4) [112, 113]. Qin и Luo [114] обнаружили, что miR-221 модулирует миграцию и инвазию клеток CRC in vitro и in vivo, и они продемонстрировали, что miR-221 может напрямую связываться с индуцирующим реверсию белком, богатым цистеином, с мотивами Kazal (RECK) 3’UTR. и способствует метастазированию в CRC. Другие сообщения показали, что STE20-подобная протеинкиназа 3 (MST3) млекопитающих может быть мишенью miR-222, и, следовательно, сверхэкспрессия miR-222 играет критическую роль в регуляции миграции и инвазии клеток CRC [56]. Гао и др. [55] продемонстрировали, что miR-222 усиливает миграцию и инвазию в клетки CRC путем специфического нацеливания на 3’UTR члена 3 ингибирующей активности меланомы (MIA3). Однако miR-222 может быть микроРНК-супрессором опухоли при CRC [92]. Ученые исследовали роль ADAM-17 (дезинтегрин и металлопротеаза 17) как нового механизма множественной лекарственной устойчивости (MDR) при полирезистентном CRC и обнаружили, что миР-222 непосредственно нацеливается на ADAM-17, который подавляется при множественной лекарственной устойчивости. Клетки CRC и повышенный апоптоз раковых клеток.


3.3. Роль miR-221/222 в развитии рака шейки матки

Несмотря на то, что в последние годы было проведено большое количество научных исследований, уровень смертности от гинекологического рака продолжает расти [97, 115]. Ранняя диагностика и ограниченные возможности лечения запущенных гинекологических раков являются факторами их высокой смертности. Однако уровень экспрессии миРНК при гинекологическом раке тесно связан с его диагнозом, клинико-патологическими особенностями и прогностическими маркерами, в то время как было обнаружено, что миР-221/222, как обычная эктопическая миРНК, находится почти на аномальной экспрессии. уровень при гинекологическом раке [116].

Сан и др. [67] наблюдали, что экспрессия miR-222 в ткани рака шейки матки была в 2,48 раза выше, чем в нормальных тканях, прилегающих к раку, по данным образцов 18 пациентов. Активация miR-222 коррелировала с ухудшением течения рака шейки матки, и анализ показал, что p27/Kip1 и PTEN отрицательно коррелировали с miR-222, которая влияла на пролиферацию и миграцию клеток Hela и SiHa, предполагая, что miR- 222 может стать новой мишенью для терапии рака шейки матки.Уилтинг и др. [95] проанализировали различные профили экспрессии miRNAs при развитии рака шейки матки и обнаружили, что высокая экспрессия miR-221 является специфическим маркером HPV-положительного рака шейки матки. Плоскоклеточный рак шейки матки (CSCC), наиболее распространенный гистологический подтип рака шейки матки, распространяется главным образом путем миграции в лимфатические сосуды или путем инвазии в соседние мягкие ткани. Вэй и др. [116] продемонстрировали более высокий уровень miR-221-3p в тканях первичного рака шейки матки человека, полученных от пациентов с раком шейки матки с метастазами в лимфатические узлы или без них, и это увеличивало злокачественность клеток рака шейки матки. Расчет и эксперимент показали, что твист-гомолог 2 (TWIST2) нацелен на промоторную область miR-221-3p.

В результате метастазирования лимфоцитов рака шейки матки транскрипция и экспрессия миР-221-3p стимулировались, и миР-221-3p нацеливалась на 3’UTR твист-гомолога 2, тем самым ускоряя метастазирование рака шейки матки лимфоциты. Некоторые последние сообщения подтверждают, что миР-221-3p характеризуется характерным обогащением и переносом секретируемыми CSCC экзосомами в лимфатические эндотелиальные клетки человека (HLEC), чтобы способствовать миграции HLEC и образованию трубочек in vitro и способствовать ангиогенезу лимфатических узлов и метастазированию в лимфатические узлы (LN). in vivo в соответствии с экспериментами как с усилением, так и с потерей функции.Кроме того, они идентифицируют вазохибин-1 ( VASh2 ) как новую прямую мишень miR-221-3p с помощью прогнозирования мишеней биоинформатики и анализов репортеров люциферазы [64]. Высокоподвижная группа AT-hook1 (HMGA1, ранее HMG-I/Y), архитектурный транскрипционный фактор, участвует в ряде опухолевых биологических процессов. Фу и др. [68] показали, что HMGA1 сильно экспрессируется в ткани CSCC, что способствует миграции и инвазии клеток рака шейки матки, и показали, что механизм активации рака HMGA1 направлен на промоторную область miR-221/222 для усиления экспрессии miR. -221/222.Среди них miR-221/222 нацелена на 3’UTR тканевого ингибитора металлопротеиназ 3 (TIMP3), в то время как TIMP3 подавляется, а MMP2/MMP9 активируется, а ось miR-221/222-TIMP3-MMP2/MMP9 участвует в миграции. и процесс инвазии (рис. 5).


3.4. Роль миР-221/222 в развитии рака яичников

Эпителиальный рак яичников (ЭРЯ) является наиболее распространенным типом рака яичников, на долю которого приходится 90% всех случаев рака яичников, а 5-летняя выживаемость относительно низка, т.е. основная причина смерти при гинекологических злокачественных опухолях [117, 118].Таким образом, раннее выявление и химиочувствительность необходимы для контроля развития заболевания и снижения смертности. Некоторые исследования показали, что экспрессия miR-221 и miR-222 в тканях и клеточных линиях рака яичников человека достигает самых высоких уровней miRNA по сравнению с иммортализованными культурами поверхностного эпителия яичников [119, 120]. Исследования показали, что миР-222 сверхэкспрессируется в случаях эпителиального рака яичников и способствует пролиферации клеток за счет подавления p27 Kip1 [71].Шанг и др. показали, что пациенты с положительной экспрессией рецептора 2 эпидермального фактора роста человека (HER2), преобразователя сигнала и активатора транскрипции 3 (STAT3) и p-STAT3 или с отрицательной экспрессией супрессоров передачи сигналов цитокинов 3 (SOCS3) имели более короткое время выживания. 72]. Более того, Ин и соавт. указывают на то, что miR-222-3p была обогащена экзосомами, высвобождаемыми из клеток EOC, и могла переноситься в макрофаги. Сверхэкспрессия miR-222-3p в макрофагах индуцирует поляризацию фенотипа М2.Предсказание TargetScould и анализ люциферазы доказали, что 3′-UTR SOCS3 является мишенью miR-222-3p в этих исследованиях. Снижение активности SOCS3 коррелирует с повышенной экспрессией активации STAT3 и индуцированной активацией пути JAK/STAT, что увеличивает количество макрофагов М2 и способствует ангиогенезу и лимфангиогенезу в микроокружении опухоли, что ускоряет прогрессирование ЭРЯ [121].

Дополнительные исследования показали, что миР-221 повышалась в 63 образцах тканей рака яичников, причем уровень миР-221 повышался при увеличении размера опухоли, более глубокой инвазии опухоли и более высокой стадии FIGO.Наблюдалась отрицательная корреляция между экспрессией белка активатора протеазы апоптоза 1 (APAF1) и миР-221 в 5 из 63 тканей рака яичников и 6 клеточных линий, включая A2780, OVCAR3, SKOV3 и 3AO5. Подтверждено, что ген APAF1 является прямой мишенью miR-221, которая индуцирует пролиферацию клеток рака яичников и препятствует апоптозу клеток рака яичников in vitro [69]. МиР-221 также нацеливается на модифицирующий фактор BCL-2 (BMF), способствующий пролиферации клеток в клеточной линии рака яичников SKOV3 [70].Амини-Фарсани и др. продемонстрировали, что в клеточных линиях эпителиального рака яичников человека A2780 S и A2780/CP miR-221/222 экспрессируется на более высоком уровне в клетках A2780/CP. Анализ жизнеспособности клеток in vitro показал, что подавление миР-221/222 повышает чувствительность клеток A2780/CP к цисплатин-индуцированной цитотоксичности. Биоинформатический анализ и репортерные анализы люциферазы доказали, что miR-221/222, как было обнаружено, напрямую нацеливается на PTEN , а miR-221/222 индуцирует устойчивость к цисплатину путем нацеливания на PTEN -опосредованный путь PI3K/Akt [73].

Подобно вышеупомянутым видам рака, другие исследования также показали, что высокая экспрессия miR-222-3p и miR-221-3p оказывает противораковое действие. Например, высокая экспрессия миР-222-3p может ингибировать разрушение раковых клеток, и пациенты с высокой экспрессией, по-видимому, обладают более высокой выживаемостью и более длительным временем выживания. Фу и др. проанализировали экспрессию miR-222-3p с помощью qRT-PCR у 74 пациентов с EOC, и результаты показывают, что чем выше средний уровень экспрессии miR-222-3p, тем дольше медиана общего времени выживания EOC.Экспрессия miR-222-3p в шести клеточных линиях рака яичников (Tara R182, SKOV3, SKOV3DDP, SKOV3IP, HO8910 и HO8910-PM) была обнаружена с помощью анализа qRT-PCR, а затем был обнаружен низкий уровень miR-222-3p. был обнаружен в клетках SKOV3/DDP и Tara R182 с высокой скоростью роста клеток. Клетки SKOV3 и HO8910-PM с низкой скоростью роста экспрессировали высокий уровень miR-222-3p. Сверхэкспрессия miR-222-3p в клеточной линии SKOV3/DDP показала, что миграция опухолевых клеток заблокирована. Когда миР-222-3p была сверхэкспрессирована в шести клеточных линиях, было обнаружено, что миР-222-3p нацеливается на полипептид 2 ингибирующей активности G-белка альфа-регулятора фосфорилирования AKT (GNAI2), который ингибирует фосфорилирование AKT, чтобы уменьшить пролиферацию рака яичников. клеток [91].Недавно также были проведены некоторые исследования, показывающие, что более высокая экспрессия miR-221-3p связана с лучшей общей выживаемостью у пациентов с ЭРЯ. Ву и др. исследовали уровень экспрессии miR-221-3p в трех клеточных линиях EOC (SKOV3, SKOV3-IP и SKOV3-R), которые показали более низкий уровень экспрессии в SKOV3-IP и SKOV3-R, но показали больше пролиферации и миграции.

Эксперименты in vitro показали, что miR-221-3p ингибирует пролиферацию и миграцию клеток EOC. Выполняя последующие систематические молекулярно-биологические, биоинформатические анализы и репортерный анализ люциферазы, ученые обнаружили и подтвердили, что фактор АДФ-рибозилирования (ARF) 4 является геном-мишенью miR-221-3p [90].Интересно, что Вурц и др. [66] обнаружили, что экспрессия белка CDKN1C (p57) отрицательно коррелировала с miR-221/222 в EOC, в то время как экспрессия белка CDKN1B (p27) не коррелировала с miR-221/222 в EOC ( Рисунок 6).


3.5. Роль миР-221/222 в эндометриальной карциноме

Эндометриальная карцинома (ЭК) является четвертой по распространенности злокачественной опухолью у женщин в развитых странах и наиболее частым раком женских половых путей; однако заболеваемость карциномой эндометрия перемещается в молодое население из-за факторов ожирения и образа жизни в Китае [122].Эстроген является классическим этиологическим фактором онкогенеза эндометрия [123]. При карциноме эндометрия нарушение регуляции ER α , вызванное геномными или эпигенетическими аберрациями, было преобладающим явлением, которое снижало экспрессию ER α и ассоциировалось с обширной инвазией, высокой стадией и плохим прогнозом [124, 125].

Лю и др. обнаружили, что экспрессия миР-222-3p была намного ниже в ER α -положительных, чем в ER α -негативных образцах ткани карциномы эндометрия, а уровень экспрессии миР-222-3p был ниже в опухолях более низкой степени и более ранней стадии. .Репортерные анализы TargetScould и люциферазы показали, что ER α был мишенью miR-222-3p. Следовательно, миР-222-3p была сверхэкспрессирована в ER α -негативных опухолях эндометриальной карциномы и была связана с метастазами высокой степени злокачественности, поздней стадии и узловыми метастазами, а высокий уровень миР-222-3p был механизмом резистентности эндометрия к ралоксифену. терапия карциномы. Более того, с помощью анализа qRT-PCR miRNA у 46 пациентов с EC и 28 женщин без рака в анамнезе было обнаружено значительное увеличение уровней миР-222 в сыворотке пациентов с карциномой эндометрия.В будущем он может быть использован в качестве подходящего маркера для диагностики карциномы эндометрия [126].

4. Заключение

Как резюмировано выше, микроРНК-221/222 (миР-221/222) представляет собой некодирующую микроРНК, широко распространенную в эукариотических организмах и активно участвующую в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов. Важно, что уровень экспрессии miR-221/222 тесно связан со стадией опухоли и прогнозом. Он может быть использован в качестве биомаркера для диагностики предраковых опухолей [104] и стать новой мишенью для терапии опухолей [8–33, 35, 38, 51, 94], в качестве терапевтического средства при лекарственной устойчивости или чувствительности к противоопухолевым препаратам. [127].

Однако необходимо ответить и на другие вопросы, которые должны быть переведены в клинические стратегии. Во-первых, учитывая сложные сети, в которых расположены раковые клетки, роль miR-221/222 в различных клеточных фонах, а также ее гены-мишени нуждаются в дополнительных разъяснениях микросетей. Например, лаборатория объявила, что миР-222 способствует пролиферации клеточной линии немелкоклеточного рака легкого человека h560 [128]; напротив, почти в то же время Yamashita и коллеги [129] продемонстрировали, что miR-221/222 способствует росту клеточных линий h560, в то время как miR-221 ингибирует рост других четырех клеточных линий NSCLC.Другим примером является то, что низкая экспрессия миР-221/222 ингибирует злокачественную пролиферацию клеток гладких мышц сосудов [130], но также ингибирует рост клеток миокарда и увеличение маркеров пролиферации мышечных клеток, вызванное физической нагрузкой [131]. Стоит отметить, что модельные микроРНК, проанализированные и трансфицированные в образцах опухолей, могут обладать изомиР-свойствами, что может привести к противоречивости некоторых результатов.

Во-вторых, по мере углубления исследований уровень экспрессии миР-221 и миР-222 не пропорционален развитию опухоли, в то время как их функции многочисленны.Поэтому ожидается, что соотношение уровня экспрессии miR-221 и miR-222 станет новой областью исследований [66].

Наконец, ожидается, что одна микроРНК может действовать как терапевтический ингибитор клеточного пути рака, регулируя различные гены, участвующие в сети. Например, miR-221/222 может ингибировать экспрессию факторов транскрипции ER- α и FOXO3A, что приводит к общему изменению экспрессии генов за счет ингибирования экспрессии ER- α и FOXO3A на посттранскрипционной стадии.Супрессированный ER- α обладает способностью негативно регулировать miR-221/222, а супрессированный FOXO3A блокирует транскрипционную активацию p27 и Bim [63]. Это показывает, что регуляция отдельных микроРНК может иметь большой терапевтический потенциал в отношении различных видов рака. Возвращаясь к клинической стратегии, было продемонстрировано, что для эффективного подавления онкомиРНК олигонуклеотиды на основе заблокированных нуклеиновых кислот (LNA-) обладают большим потенциалом в качестве ингибиторов малых РНК-мишеней [132].

Доступность данных

Некоторые или все данные, модели или код, сгенерированные или использованные в ходе исследования, можно получить у соответствующего автора по запросу.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2018YFC0310900), Открытым исследовательским фондом Государственной ключевой лаборатории химии биоорганических и натуральных продуктов (SIOC, CAS) и Выдающимся университетом Фудань. План талантов (Fudan Excellence 2025).

miR221/222 при раке: их роль в развитии опухоли и ответе на терапию

Abstract

MiRNAs представляют собой малые некодирующие РНК длиной ~24 нуклеотида, которые могут блокировать трансляцию мРНК и/или отрицательно регулировать ее стабильность. Существует большое количество доказательств того, что нарушение регуляции miRNAs является отличительной чертой рака. miRNAs часто аберрантно экспрессируются, и их функция связана с регуляцией онкогенов и/или генов-супрессоров опухолей, участвующих в клеточном сигнальном пути. МиР-221 и миР-222 являются двумя высоко гомологичными микроРНК, активация которых была недавно описана в нескольких типах опухолей человека.Считалось, что МиР-221/222 действуют как онкогены или супрессоры опухолей, в зависимости от опухолевой системы. Подавление oncomiRs или подходы генной терапии, основанные на повторной экспрессии miRNAs, которые подавляются в раковых клетках, могут представлять собой новый противоопухолевый подход для интегрированной терапии рака. Здесь мы рассмотрим роль миР-221/222 в прогрессировании рака и их использование в качестве прогностических и терапевтических инструментов при раке.

Ключевые слова: микроРНК, рак, лечение рака. матричных РНК (мРНК) генов-мишеней.MiRNAs генерируются с помощью механизма, который обычно включает транскрипцию длинного предшественника (pri-miRNA), который затем процессируется с образованием второго предшественника (pre-miRNA) длиной 60-100 нуклеотидов с помощью ядерного белка Drosha (4). Пре-миРНК транспортируется в цитоплазму, и вторая стадия процессинга осуществляется эндорибонуклеазой семейства РНКаз III, Dicer, в результате чего образуются конечные продукты микроРНК [1]. В цитоплазме дуплексы микроРНК раскручиваются, и зрелая цепь включается в РНК-индуцированный комплекс молчания (RISC).После связывания с частично комплементарными сайтами, обычно в 3′-UTR мРНК, микроРНК вызывают ингибирование трансляции и, в некоторых случаях, деградацию мРНК-мишени (2) [2]. В геноме человека закодированы сотни микроРНК и тысячи мРНК-мишеней, и это объясняет важные регуляторные роли микроРНК в путях развития, дифференцировки, пролиферации и апоптоза клеток. Следовательно, дерегуляция miRNAs вовлечена в патогенез многих заболеваний человека, включая рак.В самом деле, как потеря, так и усиление функции miRNA способствуют развитию рака с помощью ряда различных механизмов. Поскольку miRNAs регулируют дифференцировку, пролиферацию, выживание и метастазирование раковых клеток, регуляция уровней их экспрессии может обеспечить мощную терапевтическую стратегию для инициации и прогрессирования рака. МикроРНК аберрантно экспрессируются при различных типах рака, включая лейкемию [3, 4], лимфому [5], рак молочной железы [6, 7], колоректальный рак [8], рак легкого [9, 10], гепатоцеллюлярную карциному [11, 12], и рак полости рта [13–15].Нарушение регуляции (, например, , сверхэкспрессия или потеря экспрессии) этих «раковых» микроРНК способствует возникновению и прогрессированию опухоли, способствуя неконтролируемой пролиферации и выживанию, способствуя инвазивному поведению и регулируя апоптоз [16, 17]. Затем все большее число исследований продемонстрировало, что микроРНК могут функционировать как потенциальные онкогены ( oncomiRs ) или гены-онкосупрессоры ( oncosuppressor-miRs ), в зависимости от клеточного контекста и генов-мишеней.В связи с этим miR-221/222 сверхэкспрессированы в большинстве эпителиальных опухолей [18], но они могут играть опухолесупрессирующую роль в эритролейкемических клетках, ингибируя эритропоэз посредством подавления рецептора c-Kit. Здесь мы рассмотрим современные знания о роли миР-221/222 в развитии опухоли и их потенциале в качестве диагностических, прогностических и терапевтических инструментов.

биогенез микроРНК

Производство микроРНК (миРНК) из пра-миРНК представляет собой сложный и скоординированный процесс, управляемый различными группами ферментов и ассоциированных белков в ядре или цитоплазме.pri-miRNA, расположенная в ядре, превращается в pre-miRNA за счет расщепляющей активности фермента Drosha. Произведенная пре-миРНК экспортируется в цитоплазму Экспортином 5. По прибытии в цитоплазму пре-миРНК процессируется в виде дуплексов микроРНК ~18–22 нуклеотидов с помощью цитоплазматической РНКазы-III Dicer. Обычно одна цепь этого дуплекса деградирует, тогда как другая цепь накапливается в виде зрелой микроРНК. Из дуплекса miRNA-miRNA только miRNA предпочтительно входит в белково-эффекторный комплекс, образованный РНК-индуцированным комплексом сайленсинга (RISC).Совершенная или почти совершенная комплементарность между miRNA и ее целевой 3’UTR индуцирует RISC расщеплять мРНК-мишень, тогда как несовершенное совпадение оснований индуцирует в основном трансляционное сайленсинг мишени.

МиР-221/222 Роль в развитии опухоли

МиР-221/222 кодируются тандемно на Х-хромосоме у человека, мыши и крысы и высококонсервативны у позвоночных. Более того, они имеют одинаковую последовательность семян. На сегодняшний день сообщалось о многих исследованиях роли miR-221/222 в развитии рака либо как oncomiR, либо как oncosuppressor-miRs (см. и ).Сверхэкспрессия miR-221/222 наблюдалась при ряде прогрессирующих злокачественных новообразований, что указывает на то, что miR-221/222 могут быть потенциальными терапевтическими мишенями при эпителиальном раке [19]. Галарди и др. , идентифицировали регулятор клеточного цикла, p27 Kip1 , как мишень miR-221/miR-222 [20]. Они показали, что в клетках поджелудочной железы уровни экспрессии p27 Kip1 и miR-221/222 обратно коррелировали, и продемонстрировали, что сверхэкспрессия miR221/222 имеет важные последствия для скорости пролиферации и распределения фаз клеточного цикла.Затем эти результаты были подтверждены при глиобластомах [21], при папиллярных карциномах щитовидной железы [22], при раке молочной железы [23], гепатоцеллюлярной карциноме [24] и раке легкого [25]. Впоследствии многие другие гены-супрессоры опухолей были идентифицированы как мишени miR-221/222. Форнари и др. , сообщили, что CDKN1C/p57 также является прямой мишенью миР-221 в печени, предполагая, что миР-221 выполняет онкогенную функцию в гепатокарциногенезе. Действительно, трансфекция миР-221 в клетки Hep3B вызывала 1.8-кратное снижение CDKN1C/p57; и наоборот, клетки SNU449, трансфицированные антимиР-221, демонстрировали 1,3-кратное увеличение уровней белка CDKN1C/p57 по сравнению с ингибиторами микроРНК отрицательного контроля [26]. Чжан и др. , сообщили, что миР-221/222 непосредственно регулируют апоптоз путем нацеливания на PUMA при глиобластоме; более того, они обнаружили обратную связь, in vivo , между PUMA и экспрессией miR-221/222 в тканях глиомы [19]. Совсем недавно мы продемонстрировали, что miR-221/222 сверхэкспрессируются у пациентов с глиомой высокой степени злокачественности и регулируют экспрессию тирозинфосфатазы PTPµ [27].Поскольку PTPμ отрицательно регулирует миграцию клеток глиомы, сверхэкспрессия miR-221/222 имеет важные последствия в онкогенезе глиомы. Более того, наши недавние данные свидетельствуют о том, что миР-221/222 также способны регулировать реакцию на темозоломид (Quintavalle, личное сообщение) путем модуляции экспрессии фермента репарации ДНК, MGMT. Снижая экспрессию MGMT, miR-221/222 делают клетки глиомы более чувствительными к темозоломиду. Следовательно, если, с одной стороны, миР-221/222 обнаруживается в высокоинвазивной опухоли со сверхэкспрессией, с другой стороны, пациенты с более высокими уровнями миР-221/222 могут лучше реагировать на терапию.Zhao et al. . обнаружили частую повышающую регуляцию миР-221/222 в ER-α-отрицательных клеточных линиях рака молочной железы и в первичных опухолях и продемонстрировали, что эти миР ингибируют трансляцию ER-α путем прямого взаимодействия с 3′-UTR. ER-α, обеспечивающих молекулярный механизм посттранскрипционной регуляции ER-α при раке молочной железы [28]. Di Leva et al продемонстрировали петлю обратной связи в miR-221/222 и ER-α. Они показали, что miR-221/222 ингибирует экспрессию факторов транскрипции ER-α и FOXO3A и что ER-α способен подавлять активацию транскрипции miR-222/221.Репрессия FOXO3 с помощью miR-221/222, в свою очередь, блокирует активацию транскрипции p27 и Bim (10). Эти данные свидетельствуют о том, что одна микроРНК благодаря своей способности модулировать различные гены, участвующие в одной и той же сети, может действовать как сильный ингибитор всего клеточного пути, что предполагает возможный больший терапевтический потенциал для микроРНК, чем для одного гена [29]. . Terasawa et al. . обнаружили, что управляемая фактором роста нервов (NGF) активация путей киназ 1 и 2 (ERK1/2, регулируемых внеклеточным сигналом) в клетках рака предстательной железы индуцирует экспрессию миР-221/222.Используя программу прогнозирования мишени, они идентифицировали проапоптотический белок Bim как потенциальную мишень miR-221/222 [30]. Функция микроРНК зависит от клеточной конкуренции. Действительно, миР-222 ингибирует инвазию клеток плоскоклеточной карциномы языка полости рта (OTSCC). Эктопическая трансфекция miR-222 снижала экспрессию матриксной металлопротеиназы 1 (MMP1) и супероксиддисмутазы марганца (SOD2), участвующих в клеточной инвазии и метастазировании, в клеточных линиях OTSCC (14). Эти результаты показывают, что miR-222 играет важную роль в инвазии OTSCC и, таким образом, может служить новой терапевтической мишенью для пациентов с высоким риском метастатического OTSCC [31].Другое исследование Felli et al. , показали, что миР-221/222 ингибируют нормальный эритропоэз и рост эритролейкемических клеток, по крайней мере, частично посредством понижающей модуляции рецептора Kit. Действительно, в эритропоэтической культуре клеток-предшественников CD34+ пуповинной крови уровни miR-221/222 заметно снижены. В эритропоэтической культуре, подвергающейся экспоненциальному росту клеток, модуляция miR обратно пропорциональна увеличению экспрессии белка Kit. Обработка предшественников CD34+ miR-221/222 способна индуцировать нарушение пролиферации и усиление дифференцировки Е-клеток [32].Эти последние два исследования доказывают супрессорную роль miR-221/222 в OTSCC и эритроцитах, снова указывая на то, что функция микроРНК исключительно зависит от клеточного соперничества и типа опухоли (14).

МиР-221/222 как онкомиР

МиР-221/222 действуют как онкомиР путем нацеливания на важные гены-супрессоры опухолей, такие как PTEN, TIMP3, p27 Kip1 , p57, Bim. Сверхэкспрессия миР-221/222 индуцирует пролиферацию клеток за счет активации клеточного цикла и пути Akt и блокирует индуцируемый TRAIL апоптоз.Более того, miR-221/222 определяют устойчивость к фулвестранту посредством активации пути β-катенина.

МиР-221/222 в качестве миР-супрессоров опухолей

МиР-221/222 действуют как миР-супрессоры опухолей в клетках эритропоэтической линии и плоскоклеточных клетках полости рта путем нацеливания на c-Kit, матриксную металлопротеиназу 1 (ММР1) и супероксиддисмутазу марганца (СОД2).

Таблица 1

МиРНК-мишень Дерегуляция при раке Ref.
P27 / Kip1 Giloblastoma, щитовидной железы папиллярный рак, гепатоцеллюлярный рак, рак молочной железы, простаты и рак поджелудочной железы [21-25]
P57 гепатоцеллюлярной карциномы [26]
Puma Glioblastoma [19] [19] [19]
[28, 29] [28, 29]
Pten TIMP3 NSCLC, Гепатокарцинома, Гилома, Желудочный Кансер [44]
DDIT4
DDIT4 Гепатоцеллюлярная карцинома [52]
BIM Racce [30] [30]

Таблица 2

MIR-221/222 в качестве генов подавления опухоли

miRNA Target Дерегуляция при раке Ref.
Sodi MMP1 Toncue Usious Cell Carcinoma (OSCC) 31
C-Kit Эритроциты 39 32

MIR-221/222: их роль в ответ на терапию in Cancer

Недавние исследования показывают, что химиорезистентность может быть связана с нарушением регуляции функции микроРНК. Кроме того, все больше данных указывает на существование сходства между лекарственно-устойчивыми и метастатическими раковыми клетками с точки зрения устойчивости к апоптозу и повышенной инвазивности.Сверхэкспрессия miR221/222 связана с измененным ответом на терапию рака, либо на гормональную, либо на обычную химиотерапию. Исследования показывают, что miR-221/222 играют заметную роль в приобретении устойчивости к антиэстрогенам. Рецептор эстрогена-α (ERα) играет ключевую роль в развитии и прогрессировании рака молочной железы [33]. Тамоксифен, селективный модулятор рецепторов эстрогена [34], считается эндокринной терапией первой линии, которая значительно улучшает безрецидивную и общую выживаемость ER-положительного рака молочной железы на всех стадиях [35].Однако приобретенная резистентность к тамоксифену обычно развивается после длительного лечения в большинстве первоначально чувствительных раков молочной железы [36]. Более того, почти 50% пациентов с распространенным ER-положительным раком молочной железы не реагируют на тамоксифен в условиях первой линии. Из анализа профилей экспрессии генов, регулируемых miR-221/222, выяснилось, что устойчивость к тамоксифену связана с активацией нескольких сигнальных путей фактора роста, включая рецептор 2 эпидермального фактора роста человека (HER2) и рецептор инсулиноподобного фактора роста I (IGF). -IR), которые могут «взаимодействовать» с сигнальным путем ERα.Это приводит к активации митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK) и PI3K/AKT, участвующих в выживании и пролиферации клеток [35–37]. Нокдаун миР-221 и/или миР-222 повышал чувствительность клеток MDA-MB-468 к индуцированной тамоксифеном остановке роста клеток и апоптозу. Эти данные указывают на то, что miR-221/222 играют важную роль в регуляции экспрессии ERα и могут быть потенциальными мишенями для восстановления экспрессии ERα и ответа на антиэстрогенную терапию в подмножестве рака молочной железы [28].Другие исследования демонстрируют, что miR-221/222 индуцирует резистентность к фулвестранту в чувствительных к MCF-7 клетках за счет нарушения регуляции множественных онкогенных сигнальных путей, таких как активация β-катенина и репрессия ингибирования роста, индуцированного передачей сигнала TGF-β [38] (38). ). Следовательно, воздействие на эти два онкомиР может быть потенциальной терапевтической стратегией для предотвращения развития резистентности к фулвестранту или ресенсибилизации опухолей молочной железы к этому мощному антагонисту эстрогена. Феличетти и др. , сообщили, что фактор транскрипции цинкового пальца промиелоцитарного лейкоза (PLZF) является репрессором miR-221/222 путем прямого связывания с их предполагаемой регуляторной областью.В частности, они продемонстрировали, что молчание PLZF в меланомах разблокирует миР-221/222, что, в свою очередь, усилило блокаду пролиферации и дифференцировки клеток меланомы за счет понижающей модуляции p27 Kip1 и рецептора c-KIT. Функциональные исследования in vitro и in vivo , включая использование антисмысловых олигонуклеотидов «antagomiR», подтвердили ключевую роль miR-221/222 в регуляции прогрессирования меланомы человека [39]. Pu и др. , недавно сообщили, что уровни miR-221 в плазме являются потенциальным биомаркером для дифференциации пациентов с колоректальным раком (CRC) от контрольной группы.Действительно, повышенный уровень miR-221 в плазме является важным прогностическим фактором общей выживаемости у пациентов с CRC и может использоваться в качестве потенциального молекулярного маркера для диагностики и прогноза CRC [40]. Чен и др. , проанализировали различные опухоли щитовидной железы и, что интересно, обнаружили сверхэкспрессию miR-221/222 в основном в папиллярных карциномах щитовидной железы [41]. Готтардо и др. , идентифицировали повышенную регуляцию миР-221 при раке мочевого пузыря по сравнению с нормальной слизистой оболочкой мочевого пузыря, подразумевая роль миР-221 в качестве прогностического инструмента также для рака мочевого пузыря [42].Наша группа показала, что в клетках НМРЛ, устойчивых к TRAIL, уровни миР-221/222 повышены. Трансфекция анти-миР-221 и -222 делала клетки, устойчивые к CALU-1, чувствительными к TRAIL; и наоборот, h560-чувствительные клетки, обработанные miR-221/222, становятся TRAIL-резистентными. Мы сообщили, что miR-221/222 мешают передаче сигналов TRAIL главным образом через p27 kip1 (10). Таким образом, высокие уровни экспрессии miR-221/222 необходимы для поддержания устойчивого к TRAIL фенотипа, что делает эти miR многообещающими диагностическими инструментами для устойчивости к TRAIL при НМРЛ [25].Более того, интересная петля регуляции miR-221/222 и чувствительности TRAIL была недавно описана Acunzo et al. , [43]. Фактически, сообщалось, что сверхэкспрессия miR-130 способна подавлять экспрессию miR-221/222 посредством понижающей модуляции MET. Это открытие показало, как miR-130a, воздействуя на MET, способна снижать экспрессию miR-221/222 и, соответственно, устойчивость к TRAIL в клетках NSCLC, и убедительно подтверждает участие miR-221/222 в регуляции чувствительности к TRAIL.

Действительно, стратификацию опухоли на основе уровней экспрессии miR-221/222 можно использовать в качестве прогностического инструмента для прогнозирования TRAIL-чувствительности или TRAIL-резистентности при лечении НМРЛ [25].

miR-221/222 в качестве терапевтического средства

В нескольких сообщениях указывается, что miR-221/222 можно использовать в качестве терапевтического средства для модулирования резистентности или чувствительности к противораковым агентам. Наша группа недавно обнаружила, что МЕТ посредством активации транскрипции Jun повышает экспрессию миР-221/222, которая, в свою очередь, путем нацеливания на PTEN и TIMP3 придает устойчивость к TRAIL-индуцированной гибели клеток и повышает туморогенность клеток рака легких и печени [44]. ].PTEN представляет собой липидфосфатазу, которая непосредственно противодействует активности фосфатидилинозитол-3-ОН киназы (PI3K) [45]. Его инактивация приводит к конститутивной активации пути PI3K/AKT и последующему увеличению синтеза белка, прогрессии клеточного цикла, миграции и, что наиболее важно, выживаемости [46]. TIMP3 принадлежит к семейству тканевых ингибиторов металлопротеиназ (TIMP), в которое входят четыре члена семейства (TIMP1–4) [47]. Они ингибируют активность металлопротеиназ (ММР), связываясь с активным центром в соотношении 1:1 [48], но другие исследования показали, что TIMP3 способствует апоптотической гибели клеток [49, 50].

Другое исследование Chun-Zi et al. , продемонстрировали, что миР-221 и миР-222 регулируют радиочувствительность, рост клеток и инвазию клеток желудка, посредством прямой модуляции экспрессии PTEN [51]. Эти результаты позволяют предположить, что ингибирование миР-221 и миР-222 может формировать разработана новая терапевтическая стратегия не только для повышения чувствительности опухолевых клеток к апоптозу, вызываемому лекарственными препаратами, но и для подавления их выживания, пролиферации и инвазивных способностей.

Недавно Pineau et al., [52] идентифицировали индуцируемый повреждением ДНК транскрипт 4 (DDIT4), модулятор пути mTOR, в качестве мишени miR-221. Они вводили в клетки рака печени LNA-модифицированные антимиР-221 и антимиР-222. Лечение антагомиР, но не скремблированными олигонуклеотидами, уменьшало рост клеток рака печени, которые сверхэкспрессировали миР-221/222. Таким образом, использование синтетических ингибиторов miR-221 может оказаться многообещающим подходом к лечению рака печени [52]. Галарди и др. показали, что нокдаун miR-221/222 с помощью антисмысловых олигонуклеотидов LNA увеличивает p27 Kip1 в клетках рака предстательной железы человека (PC3) и сильно снижает их клоногенность в in vitro , тогда как модель ксенотрансплантата у мышей SCID продемонстрировала, что эктопическая сверхэкспрессия miR- 221 может дать большое преимущество в росте.Соответственно, лечение установленных подкожных опухолей антаго-миР 222/221 снижает рост опухоли за счет увеличения внутриопухолевого количества p27 [20]. Интересно, что Ван и др. . сконструировали аденовирусно-экспрессируемые shRNAs, которые функционально ко-репрессируют экспрессию miR-221/222 в клетках глиобластомы, повышая уровни экспрессии p27, вызывая остановку клеточного цикла в фазе G1 и апоптоз [53]. Наконец, Погрибный и др. , изучали роль изменений микроРНК в приобретении устойчивого к цисплатину фенотипа в клетках аденокарциномы молочной железы человека MCF-7.Они идентифицировали в общей сложности 103 микроРНК (46 с повышенной экспрессией и 57 с пониженной экспрессией) в клетках MCF-7, устойчивых к цисплатину. Среди наиболее активно регулируемых miR они обнаружили miR-221/222, участвующую в контроле передачи клеточных сигналов и выживании клеток [54]. Наши недавние данные демонстрируют, что miR-221 и -222 активируются в стволовых клетках рака молочной железы, полученных от пациентов или из культивируемых клеток MCF7, выращенных в суспензии (личное сообщение Condorelli). Их роль в поведении раковых стволовых клеток находится в стадии изучения.

МиР-221/222 способствует эпителиально-мезенхимальному переходу путем нацеливания на Notch4 в клеточных линиях рака молочной железы

Notch4 сверхэкспрессируется в люминальных клетках рака молочной железы и имеет обратную корреляцию с миР-221/222

Наше более раннее исследование показало, что Notch4 поддерживает люминальный фенотип и подавляет метастазирование опухоли при раке молочной железы. Как показано на рис. 1а, высокие уровни мРНК Notch4 были специфически экспрессированы в ERα-положительных клеточных линиях просветного рака молочной железы MCF-7 и T-47D, но не в ERα-отрицательных клеточных линиях рака молочной железы MDA-MB-231, БТ-549 и СК-БР-3.Вестерн-блоттинг показал, что как полноразмерный, так и внутриклеточный домен (ICD) Notch4 в основном экспрессировались в люминальных эпителиальных фенотипах клеточных линий MCF-7 и T-47D, о чем свидетельствует повышенная экспрессия ERα и E-кадгерина (рис. 1b). Однако экспрессия Notch4 не была обнаружена в клеточных линиях базальноподобного рака молочной железы MDA-MB-231, BT-549 и SK-BR-3, которые экспрессируют мезенхимальный маркер виментин (рис. 1б).

Рис. 1

miR-221/222 имеют обратную корреляцию с Notch4 в клетках рака молочной железы. a qRT-PCR анализ экспрессии мРНК Notch4 в клеточных линиях рака молочной железы. b Полноразмерный эндогенный Notch4 (FL) и внутриклеточный домен (ICD), уровни белка ERα, E-кадгерина и виментина в клеточных линиях рака молочной железы. c, d Базы данных для прогнозирования генов-мишеней миР-221/222 и выравнивания последовательностей исходных областей миР-221 и миР-222 человека с 3’UTR Notch4, который содержит предполагаемый сайт связывания миР-221/222. e qRT-PCR анализ экспрессии миР-221/222 в клеточных линиях рака молочной железы , базы данных miRWalk и RNAhybrid) для идентификации предполагаемых микроРНК, нацеленных на Notch4.Среди идентифицированных микроРНК-кандидатов 3′-UTR Notch4 человека содержит области, которые соответствуют начальным последовательностям hsamiR-221 и hsamiR-222 (Fig. 1c, d). Кроме того, мы исследовали эндогенные уровни miR-221/222 с помощью qRT-PCR. Экспрессия обеих миРНК была почти неопределяемой в просветных клетках рака молочной железы MCF-7 и T47D, но миР-221/222 была высоко экспрессирована в базальноподобных клетках подтипов SKBR3, MDA-MB-231 и BT549 (рис. 1e). . Поскольку наши данные показали обратную корреляцию между миР-221 или миР-222 и экспрессией Notch4 в клетках рака молочной железы, мы предположили, что Notch4 может быть мишенью миР-221/222.

МиР-221/222 подавляют экспрессию белка Notch4 и индуцируют ЭМП

Чтобы изучить роль миР-221 и миР-222 в регуляции Notch4 и ЭМП, мы трансфицировали синтетические олигомиметики миР-221 и миР-222 в грудную клетку MCF-7. раковые клетки. Экспрессия обеих микроРНК увеличивалась примерно в 1000 раз через 48 ч трансфекции миметиками (рис. 2а). С помощью qRT-PCR мы обнаружили, что уровень мРНК Notch4 не изменился в клетках, трансфицированных miR-221 или miR-222, по сравнению с контрольной группой (рис.2б). Напротив, сверхэкспрессия miR-221/222 значительно снижала уровни эндогенного Notch4 (как полноразмерного, так и ICD), ERα, p27 и белка E-кадгерина (Fig. 2c). Напротив, добавление ингибиторов miR-221/222 к клеткам MDA-MB-231 (рис. 2d) значительно индуцировало экспрессию ICD Notch4 и E-кадгерина, в то время как экспрессия виментина значительно снижалась. Как и ожидалось, p27 и ERα, являющиеся мишенями miR221/222, также активировались ингибированием miR-221/222 (рис. 2f). Интересно, что уровни мРНК Notch4 не изменились в клетках, трансфицированных ингибитором miR-221/222 (фиг.2e), указывая на то, что miR-221/222 регулируют Notch4 только на уровне трансляции. Чтобы дополнительно подтвердить роль miR221/222 в регуляции Notch4, мы временно трансфицировали клетки MCF-7 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-221/222, а также пустым вектором pcDNA6.2-GW/EmGFP. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что уровни Notch4 были в значительной степени снижены в клетках, экспрессирующих miR-221/222, по сравнению с клетками, трансфицированными только GFP, или нетрансфицированными клетками (рис. 2g).

Рис. 2

Notch4 является мишенью миР-221/222 в клетках рака молочной железы. a Уровни экспрессии миР-221 и миР-222 определяли с помощью qRT-PCR после принудительной трансфекции миметиков миР-221 или миР-222 в клетки MCF-7. b qRT-PCR мРНК Notch4 после принудительной трансфекции миметиков miR-221 и miR-222 в клетки MCF-7. c Вестерн-блот анализ уровней эндогенного белка Notch4, ERα, p27 и E-кадгерина в клетках MCF-7 после эктопической экспрессии миметиков miR-221/222 в клетках MCF-7. d, e qRT-PCR эндогенной мРНК miR-221/222 и Notch4 в клетках MDA-MB-231 после трансфекции ингибиторами miR-221/222. f Вестерн-блот анализ уровней белка N3FL, N3ICD, ERα, p27 и виментина после трансфекции ингибиторами miR-221/222 в клетках MDA-MB-231. г Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток MCF-7, транзиентно трансфицированных вектором GFP (экспрессирующим только GFP), GFP-miR-221 или GFP-miR-222 с использованием антитела против Notch4. Сигналы Notch4 (красные) в клетках, трансфицированных миР-221 и миР-222, помечены стрелками. DAPI, 4′,6-диамидино-2-фенилиндол

МиР-221 и миР-222 напрямую нацелены на 3’UTR Notch4, чтобы ингибировать экспрессию Notch4

Чтобы подтвердить, что Notch4 является прямой мишенью миР-221/222, репортер Notch4 типа (WT) pMIR-Notch4-3’UTR WT или контрольный репортер был совместно трансфицирован с AgomiR221/222 (миметиками) в клетки MCF-7, которые экспрессируют низкие уровни miR-221 и miR-222 (фиг.3а). Как и ожидалось, агомиР-221 и агомиР-222 снижали активность люциферазы репортера Notch4 примерно на 50~80% в клетках MCF-7 дозозависимым образом, в то время как на контрольный репортер это не влияло (рис. 3b, c). . Точно так же активность люциферазы также снижалась с помощью AgomiR-221/222, что было визуализировано с помощью биолюминесцентной визуализации и последующей количественной оценки (рис. 3d-g). Для дальнейшего изучения того, регулирует ли miR-221/222 непосредственно Notch4 путем нацеливания на сайт связывания семян GTGTAGCT, мы совместно трансфицировали pMIR-Notch4 3’UTR WT или мутированные репортеры с миметиками и ингибиторами miR-221/222 (antagomiR-221/222). в указанных концентрациях в клетках MCF-7.Интересно, что дозозависимый ингибирующий эффект miR-221/222 на активность 3’UTR Notch4 устранялся за счет коэкспрессии ингибиторов miR-221/222. Однако при использовании мутантного репортера Notch4 3’UTR не наблюдалось существенных изменений активности люциферазы (рис. 3з, и). Напротив, ингибиторы miR-221/222 повышали активность люциферазы в клетках MDA-MB-231 дозозависимым образом при совместной трансфекции с репортером pMIR-Notch4-3’UTR WT. Повышенная активность люциферазы обращалась при совместной экспрессии с миметиками miR-221/222 (фиг.3к, к). Таким образом, эти результаты подтверждают биоинформатическое предсказание, что Notch4 является прямой мишенью miR-221 и miR-222.

Рис. 3

МиР-221/222 напрямую нацеливается на Notch4 3’UTR. a Схематический репортер люциферазы, содержащий предсказанные последовательности Notch4 дикого типа (WT) или его мутантные 3’UTR для миР-221/222. b, c Клетки MCF-7 котрансфицировали репортерами pMIR-Notch4-3’UTR WT или pMIR control в присутствии AgomiR-221/222 (10, 30 и 90  нМ) или miR-control (NC ).Активность Fluc/Rluc измеряли через 48 ч после трансфекции и нормализовали к соответствующему контролю вектора. Каждую трансфекцию проводили в трех повторностях, и эксперимент повторяли трижды. Данные представляют собой среднее значение ± SEM. *** Р <  0,001. d, e Клетки MCF-7 , стабильно трансфицированные pMIR-Notch4-3’UTR, обрабатывали AgomiR-221/222 в указанных концентрациях или вектором pMIR-control, и активность люциферазы определяли через 48 ч после трансфекции методом молекулярной визуализации устройство (IVIS KINETIC). f, g Количественное определение активности люциферазы при трансфекции агомиР-221 и агомиР-222 в системе IVIS KINETIC. ч, i Клетки MCF-7 котрансфицировали репортерами pMIR-Notch4-3’UTR дикого типа (WT) или pMIR-Notch4-3’UTRmutant (мутант) в присутствии AgomiR-221/222 (10 , 30 нМ) и антагомиР-221/222 (10, 30 нМ) или миР-контроль (НК). Активность Fluc/Rluc измеряли через 48 ч после трансфекции и нормализовали к соответствующему контролю вектора. j, k Клетки MDA-MB-231 котрансфицировали репортерами pMIR-Notch4-3’UTR в присутствии антагомиR-221/222 (10, 30 нМ) и AgomiR-221/222 (10, 30 нМ ) или miR-контроль (NC).Активность Fluc/Rluc измеряли через 48 ч после трансфекции и нормализовали к соответствующему контролю вектора. Каждую трансфекцию проводили в трех повторностях, и эксперимент повторяли трижды. Данные представляют собой среднее ± SEM

МиР-221/222 индуцируют ЭМП за счет подавления Notch4

Плазмиды GFP-миР-222. Вестерн-блоттинг показал, что сверхэкспрессия миР-221 или миР-222 снижает экспрессию Notch4, ERα и E-кадгерина в клетках MCF-7 (фиг.4а). Впоследствии мы исследовали, вызывает ли сверхэкспрессия миР-221/222 морфологические изменения, связанные с ЕМТ в клетках MCF-7. Клетки MCF-7, трансфицированные miR-221 и miR-222, демонстрировали фибробластоподобную морфологию и демонстрировали рассеяние клеток по сравнению с контрольными клетками, которые сохраняли фенотип булыжника с сильной межклеточной адгезией (рис. 4b). Затем мы исследовали, влияют ли миР-221 и миР-222 на клеточную миграцию и инвазию в клетки рака молочной железы. Сообщалось, что миР-221/222 способствуют пролиферации рака человека.Чтобы устранить эти воздействия, бессывороточная среда использовалась в анализе заживления ран и анализе трансвелла (дополнительная фигура 1A – D). В анализе заживления ран сверхэкспрессия миР-221 или миР-222 в клетках MCF-7 приводила к примерно 2-кратному увеличению скорости миграции клеток по сравнению с контрольной группой через 48 часов в культуре (рис. 4c, d и дополнительные). Рисунок 1Е). Более того, анализы Transwell, покрытые матригелем (для инвазии) или непокрытые (для миграции), показали, что сверхэкспрессия миР-221 и миР-222 резко увеличивает миграцию (примерно в 2 раза) и инвазивность (в 5 раз) клеток MCF-7. линия; при сверхэкспрессии N3ICD путем транзиторной трансфекции увеличение инвазии и миграции практически полностью подавлялось (рис.4д-з). И наоборот, экспрессия ингибиторов миР-221 или миР-222 в клетках MDA-MB-231 снижала скорость миграции примерно на 50% по сравнению с контрольной группой через 24 часа (рис. 5а, б). Клетки MDA-MB-231, обработанные ингибитором миР-221 или миР-222, демонстрировали значительно сниженные миграционные и инвазивные способности по сравнению с контрольными клетками (рис. 5в, г). Эти результаты подтверждают, что miR-221 и miR-222 способствуют миграции и инвазии за счет ингибирования экспрессии Notch4.

Рис. 4

Сверхэкспрессия N3ICD изменяет продвижение EMT miR-221 и miR-222 в клетках MCF-7.Вестерн-блоттинг и показывает, что клетки MCF-7, стабильно трансфицированные векторами GFP-miR-221 и GFP-miR-222, подавляли ICD Notch4 и ERα, а также E-кадгерин. b Влияние сверхэкспрессии miR-221/222 на морфологию клеток оценивали с помощью фазово-контрастной микроскопии (×100). Шкала баров представляет 50   мкм. c, d Репрезентативные микрофотографии (×40) анализа заживления ран в клетках MCF-7. Клетки фотографировали для измерения длины раны через 0 и 48 часов. Продолжительность заживления раны измеряли в 5 случайных полях.Данные представляют собой среднее значение трех повторных экспериментов   ±   SEM. e–h Репрезентативные микрофотографии (×200) анализов миграции и инвазии Transwell. Стабильно трансфицированные клетки miR-221/222 MCF-7 котрансфицировали N3ICD или контрольной плазмидой. Вторгшиеся или мигрирующие клетки подсчитывали в 5 случайных полях. Данные представляют собой среднее значение трех повторных экспериментов   ±   SEM. Масштабные полосы представляют собой 50 мкм

Рис. 5

Ингибирование миР-221/222 снижает миграцию и способность к инвазии в клетках рака молочной железы MDA-MB-231. a, b Репрезентативные панели из анализа ран с царапинами в клетках MDA-MB-231, визуализированные под микроскопом. Клетки MDA-MB-231 трансфицировали ингибитором miR-221/222 или miR-контролем. Заживление ран измеряли в 5 случайных полях. Данные представляют собой среднее значение трех повторных экспериментов   ±   SEM. c, d Репрезентативные микрофотографии (×200) анализов Transwell с покрытием или без покрытия в клетках MDA-MB-231, трансфицированных ингибиторами miR-221/222 или miR-NC. Клетки фотографировали для измерения длины раны через 0 и 24 часа.Вторгшиеся или мигрирующие клетки подсчитывали в пяти случайных полях. Данные представляют собой среднее значение трех повторных экспериментов   ±   SEM. Шкала баров представляет 50   мкм. * P <  0,05; ** Р <  0,01; *** P <  0,001

Границы | МикроРНК-221/222 опосредует индуцированную ADSC-экзосомой кардиозащиту от ишемии/реперфузии путем нацеливания на PUMA и ETS-1

Введение

Для пациентов с инфарктом миокарда (ИМ) тромболизис или чрескожное коронарное вмешательство (ЧКВ) являются своевременным и эффективным методом реперфузии миокарда, который может уменьшить острое ишемическое повреждение миокарда и ограничить размер ИМ (Hausenloy and Yellon, 2013).Хотя безопасная кардиохирургическая техника может улучшить хирургические результаты, сам процесс реперфузии может вызвать гибель клеток сердца, известную как повреждение сердечной ишемии/реперфузии (I/R) (Dhalla et al., 2000; Hausenloy and Yellon, 2013). И/Р-повреждение включает в себя ряд сложных событий, включая повышенный окислительный стресс, индуцированное воспаление, запуск апоптоза и гипертрофии миокарда, и может усугубить повреждение сердца и составлять до 50% размера инфаркта (Yellon and Hausenloy, 2007; Heusch et al., 2007). др., 2013; Сантос-Гальего и др., 2016). Хотя были предприняты усилия, чтобы понять механизмы, вызывающие повреждение сердца при И/Р, молекулярные и клеточные события, которые регулируют повреждение сердца после И/Р, до сих пор изучены лишь частично. Таким образом, необходимы новые фармакологические вмешательства для предотвращения повреждения И/Р и потенциального улучшения клинических исходов у пациентов с острым ИМ, перенесших ЧКВ (Heusch and Gersh, 2017; Li Y. et al., 2019).

Стволовые клетки жировой ткани (ADSC) играют жизненно важную роль в заживлении ран.Недавние исследования показали, что экзосомы, мембранные липидные нановезикулы диаметром 30–100 нм, секретируемые стволовыми клетками, способствуют паракринной передаче сигналов (Hu et al., 2016; Eguchi et al., 2019). Экзосомы этих клеток обладают преимуществами высокой стабильности, неиммунного отторжения, самонаведения и легкого контроля дозы и концентрации (Hu et al., 2016). Однако прямых доказательств механизма их действия нет. Согласно предыдущим исследованиям, экзосомы являются важными медиаторами передачи межклеточного сигнала, так как в экзосомах имеется множество микроРНК (миРНК) и белков (Waldenström and Ronquist, 2014).miRNA представляют собой небольшие (∼22 nt) некодирующие РНК, которые отрицательно регулируют экспрессию кодирующих белок генов путем ингибирования трансляции мРНК (Valencia-Sanchez et al., 2006). Экспрессия miRNA связана с сердечными событиями, такими как передача электрических сигналов, сокращение мышц, рост сердца и морфогенез (Yang et al., 2007; Zhao et al., 2007). Все больше данных указывает на то, что изменения в профилях экспрессии микроРНК часто можно обнаружить при сердечных заболеваниях, таких как ИМ и сердечная недостаточность (Abdellatif, 2012).Следовательно, возможно манипулировать микроРНК для достижения терапевтических эффектов (Barraclough et al., 2019). миР-221 и миР-222 (кластеры миР-221/222) имеют одну и ту же «исходную» последовательность, эволюционно консервативные и короткие участки на своих 5′-концах, через которые они связываются со своими сайтами-мишенями в 3′-нетранслируемой области (UTR) мРНК. (Сонг и др., 2017). Этот кластер не регулируется при раке человека, атеросклеротическом ремоделировании сосудов и вирусном миокардите (Чистяков и др., 2015; Corsten et al., 2015).МиР-221/222 нацеливается на активируемый p53 модулятор апоптоза (PUMA) и действует как регулятор апоптоза эпителиальных клеток (Zhang et al., 2010). miR-221/222 также нацеливается на протоонкоген 1 ETS (ETS-1) (Zhu et al., 2011). Однако роль миР-221/миР-222 в сердце во время И/Р до сих пор неизвестна, и дальнейшие исследования все еще продолжаются. Предыдущие исследования показали, что PUMA и ETS-1 могут регулировать апоптоз и гипертрофию соответственно (Zhan et al., 2005; Mandl et al., 2011). Принимая во внимание все эти факторы, цель этого исследования состояла в том, чтобы изучить, может ли miR-221/222 участвовать в регуляции апоптоза и гипертрофии клеток миокарда H9c2, а также ИМ путем нацеливания на PUMA и ETS-1.Наши результаты показывают, что PUMA и ETS-1 участвуют в индуцированном H 2 O 2 апоптозе и гипертрофии путем снижения экспрессии miR-221/222 в клетках H9c2. Сверхэкспрессия миР-221/222 противодействует этим явлениям в клеточных моделях и мышиных моделях I/R. Мы также обнаружили, что экзосомы, полученные из ADSC, могут снижать клеточный апоптоз и клеточную гипертрофию, что полезно при повреждении I/R. Эти данные обеспечивают убедительные доказательства того, что ADSC-Exo имеет перспективы клинического применения для лечения И/Р.

Материалы и методы

In vivo И/Р-модель миокарда и перенос ADSC-Exo В этом исследовании использовали

самца мышей C57BL/6 дикого типа (WT) и мышей с нокаутом miR-221/222 (KO) (масса тела: 25–30 г; возраст: 8–12 недель). Мы создали мышей miR-221/222 KO путем удаления X-сцепленного гена miR-221/222 и скрещивали их в течение 10 поколений на фоне C57BL/6. Мышей анестезировали изофлураном, а сердце подвергали И/Р хирургии. Короче говоря, ишемия была достигнута путем лигирования передней нисходящей ветви левой передней нисходящей коронарной артерии (LAD) нейлоновым швом 7-0 и размещения силиконовой трубки (наружный диаметр 86 мм) на 1 мм ниже нее.Эффективность окклюзии проверяли побелением желудочка на дистальном конце перевязки. Затем через 25 мин после окклюзии ADSC-Exo (100 мкг белка в 50 мкл) равномерно внутримышечно вводили в пограничную зону передней стенки левого желудочка в пяти позициях. Через 30 мин окклюзии силиконовую трубку удаляли для реперфузии. После 30 мин ишемии и 3 ч реперфузии всех мышей повторно анестезировали и вскрывали грудную клетку. Образцы сердца и крови были получены для дальнейшего анализа.В плацебо-группе сердце обнажали без перевязки ПМЖВ. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями по уходу за животными Национального тайваньского университета (утверждение IACUC №: 20150502) и в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, публикация NIH № 86–23, пересмотренная в 1985 г.

Физиологическая оценка сердечной функции

Влияние И/Р и ADSC-Exo на сердечную функцию оценивали с помощью эхокардиографии. Эхокардиографию выполняли с помощью специальной ультразвуковой системы высокого разрешения для мелких животных (Prospect, S-Sharp, Тайбэй, Тайвань), оснащенной одноэлементным преобразователем с частотой 40 МГц.Записи в М-режиме, записанные на уровне папиллярной мышцы левого желудочка в проекции по длинной оси, использовались для оценки фракционного укорочения (FS) и фракции выброса (EF).

Культура клеток

Эмбриональные клетки H9c2, полученные из сердца крысы, были приобретены в Американской коллекции типовых культур (VA, США) и культивированы в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM, GIBCO, NY, United States) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) , 110 мг/мл пирувата натрия, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°C во влажной атмосфере, содержащей 5% CO 2 .Если не указано иное, клетки обрабатывали 50 мкМ H 2 O 2 в течение 48 часов. Клетки H9c2 предварительно обрабатывали ADSC-Exo (2 мкг/мл) в течение 4 часов, а затем обрабатывали 50 мкМ H 2 O 2 в течение 48 часов. Человеческие ADSC были приобретены у LONZA (Базель, Швейцария). ADSC культивировали в среде DMEM, содержащей 20% FBS и пенициллин/стрептомицин. Для всех экспериментов использовали клетки между пассажами 3 и 8.

Экстракция, очистка и характеристика ADSC-Exo

ADSC обрабатывали трипсином и высевали по 5 × 10 5 клеток в 10-сантиметровую чашку.Через 24 часа культуральную среду собирали и центрифугировали при 3000 g в течение 15 минут для удаления клеток и клеточного дебриса. ADSC-Exo выделяли из 10 мл культуральной среды с использованием 2 мл ExoQuick-TC TM Exosome Precipitation Solution в соответствии с инструкциями производителя (System Biosciences, CA, США). После инкубации в течение ночи при 4°С смесь центрифугировали при 10000 g в течение 30 мин при 4°С. Осадок промывали 1 мл PBS и центрифугировали при 4°C в течение 15 мин при 10 000 g .Затем очищенные ADSC-Exos полностью суспендировали в 50 мкл PBS и хранили при -80°C для дальнейшего изучения. Содержание белка в экзосомах определяли количественно с использованием метода Бредфорда. Очищенный ADSC-Exo характеризовали с использованием биомаркеров CD63 и CD9 с помощью вестерн-блоттинга. Морфологию и размер ADSC-Exo наблюдали под просвечивающим электронным микроскопом (Hitachi, Токио, Япония). Анализ отслеживания наночастиц (NTA) использовали для оценки концентрации и распределения размеров ADSC-Exo.Подробные методы и результаты характеристики ADSC-Exo были описаны в дополнительных данных. Сердечный и клеточный захват ADSC-Exo исследовали с использованием набора для мечения PKH-26 (Sigma, Миссури, США) и наблюдали под конфокальным микроскопом.

Обнаружение лактатдегидрогеназы (ЛДГ)

Повреждение миокарда оценивали путем измерения уровня ЛДГ в крови. Использовали коммерческий набор для анализа ЛДГ (Abcam, Массачусетс, США). Все процедуры проводились в соответствии с инструкциями производителя.

Измерение производства активных форм кислорода (АФК)

2′,7′-дихлордигидрофлуоресцеиндиацетат (DCFDA) (Thermo, Массачусетс, США) и дигидроэтидий (DHE) (Invitrogen, Массачусетс, США) использовали для определения уровней внутриклеточных окислительных свободных радикалов и супероксидных анионов соответственно. Криостатные срезы сердца инкубировали с 2 мкМ ДГЭ в темноте при 37°С в течение 20 мин. Клетки H9c2 окрашивали DCFDA (10 мкМ) в темноте при 37°C в течение 1 часа.Окислительный стресс исследовали и наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа. Интенсивность флуоресценции DHE дополнительно определяли количественно с помощью ImageJ (NIH, MD, United States), а относительную экспрессию выражали как кратность изменения по сравнению с контролем.

Оценка апоптоза с помощью TdT-опосредованного анализа dUTP Nick End-Labeling (TUNEL)

Для изучения апоптоза использовали парафиновые срезы толщиной 5 микрометров образцов сердца, полученных при И/Р, или культивируемых кардиомиоцитов. В соответствии с инструкциями производителя апоптоз выявляли с помощью набора для анализа TUNEL ( In Situ Cell Death Detection Kit, Roche, CA, США).Процент TUNEL-положительных ядер по отношению к общему количеству ядер определяли вслепую путем расчета пяти случайно выбранных 40-кратных полей зрения на каждом покровном стекле на каждом предметном стекле. Кроме того, окрашивание TUNEL использовали для оценки апоптоза клеток H9c2 с помощью проточной цитометрии.

Вестерн-блот-анализ

Вестерн-блоттинг

выполняли, как описано ранее (Liang et al., 2011). Сердце измельчали ​​в жидком азоте и гомогенизировали в буфере RIPA (TOOLS, New Taipei City, Тайвань) с добавлением смеси ингибиторов протеазы (Genestar Biotechnology, Тайвань).Кроме того, для приготовления клеточных лизатов клетки лизировали в буфере RIPA со смесью ингибиторов протеаз при 4°C в течение 1 ч с последующим центрифугированием при 14000 g в течение 15 мин при 4°C, супернатант сохраняли. Равное количество супернатанта (20 мкг белка) подвергали 10% SDS-PAGE, а затем переносили на мембрану PVDF (Merck, Нью-Джерси, США). Затем мембрану инкубировали с 5% обезжиренным молоком в трис-буферном солевом растворе, содержащем 0,2% Tween 20 (TBST), в течение 1 ч при комнатной температуре (КТ).Блоты инкубировали с первичными антителами следующим образом: ETS-1, PUMA и CD9 были приобретены у Abcam, CD73 и CD63 были приобретены у GeneTex (Hsinchu, Тайвань), HIF-1α и фосфорилированный p53 были приобретены у Cell Signaling (MA, США), BCL-2 был приобретен у BD (Калифорния, США), а ANP был приобретен у Санта-Крус (Техас, США) в течение ночи при 4°C. Затем клетки инкубировали с конъюгированными с пероксидазой хрена козьими антителами против IgG кролика в течение 1 ч (Jackson ImmunoResearch, CA, США).Chemiluminescence Reagent Plus (NEN, Массачусетс, США) использовали для проявления сигнала, а изображения получали с помощью системы визуализации Biospectrum 600 (UVP, Калифорния, США). Количественную оценку интенсивности каждой полосы выполняли с помощью ImageJ. В качестве контроля загрузки использовали антитело против GAPDH (Proteintech, IL, США).

Окрашивание агглютинином зародышей пшеницы (WGA)

Сердце разрезали пополам, формируя поперечный срез между атриовентрикулярной бороздой и верхушкой.Базовый образец фиксировали в 10% формалиновом буфере, заливали в парафин и разрезали на срезы толщиной 5 мкм. Площадь поперечного сечения кардиомиоцитов измеряли на изображениях, полученных в срезах, окрашенных 5 мкМ WGA (Thermo, MA, США). Клетки H9c2 подвергали воздействию 50 мкМ H 2 O 2 или указанной обработке в течение 48 часов. После фиксации 4% параформальдегидом клетки инкубировали с 5 мкМ WGA в течение 10 мин при комнатной температуре. Изображения наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа. Площадь поверхности измеряли с помощью ImageJ для проверки гипертрофии, и значение выражали как кратное изменение по сравнению с контролем.

Измерение объема клетки

Клетки

H9c2 обрабатывали 50 мкМ H 2 O 2 в течение 48 ч или указанной обработкой, а затем трипсинизировали и суспендировали в PBS для анализа проточной цитометрии. Объем клеток анализировали в режиме прямого рассеяния (FSC) с помощью проточной цитометрии, и значение выражали как изменение объема (%) по сравнению с необработанной группой. Кроме того, клетки, подвергнутые указанным обработкам, фотографировали с помощью инвертированного микроскопа. Изображения были подвергнуты измерению площади поверхности с помощью ImageJ, и значение было выражено как кратное изменение по сравнению с контролем.

Иммуноокрашивание

Культивированные клетки или парафиновые срезы сердца инкубировали со специфическими первичными антителами (разведение 1:100 для антитела против PUMA, 1:100 для антитела против ETS-1) при 4°C в течение ночи. Затем срезы инкубировали с конъюгированными с биотином козьими антикроличьими IgG (разведение 1:200; Vector Lab, Соединенное Королевство) в течение 1 ч при комнатной температуре. Наконец, реакцию развивали с помощью DAB, клетки докрашивали гематоксилином и исследовали с помощью световой микроскопии.

Выделение РНК и количественная ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR)

Тотальную РНК выделяли из клеток с использованием реагента TRIzol (Thermo) в соответствии с инструкциями производителя.Для получения матрицы кДНК использовали набор TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Invitrogen, CA, США). Для анализа экспрессии miR-221/222 проводили RT-qPCR с использованием TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA, США). Наборы для анализа микроРНК TaqMan для miR-221 (000524), miR-222 (002276) и RNU6B (001973) были получены от Applied Biosystems. Все реакции проводили в трехкратной повторности. Количество миР-221/222 определяли путем стандартизации по сравнению с RNU6B.

Преходящая трансфекция

клеток H9c2 высевали в 6-луночный планшет в концентрации 3 × 10 5 клеток на лунку и трансфицировали специфическими миметиками miR-221/222 (100 нМ) (Dharmacon, CO, США) или меченными FAM миметиков (GenePharma, Шанхай, Китай) или ингибитора дуплексной РНК (Dharmacon) с использованием реагента Lipofectamine 3000 в соответствии с протоколом производителя с последующим анализом экспрессии ETS-1 и PUMA, апоптоза и гипертрофии.Нецелевые последовательности использовали в качестве отрицательного контроля.

Нокдаун

PUMA или ETS-1 осуществляли с помощью специфической siRNA (1 мкМ) с использованием липофектамина 3000. Понижающая регуляция ETS-1 и PUMA была подтверждена вестерн-блоттингом. Кроме того, у Dharmacon были приобретены полноразмерные кДНК, кодирующие ETS-1 и PUMA крысы. Транзиторную трансфекцию клеток H9c2 проводили с помощью реагента Lipofectamine 3000.

Трансфекцию in vivo проводили с помощью реагента для трансфекции TurboFect in vivo (Thermo), а миметики или ингибиторы miR-221/222 (50 пмоль) готовили в концентрации 50 мкл в соответствии с инструкциями производителя.Процесс трансфекции in vivo следовал протоколу I/R с инъекцией ADSC-Exo. Смесь миметиков или ингибиторов по 50 мкл равномерно вводили внутримышечно в пограничную зону передней стенки левого желудочка в пяти позициях.

Репортерный анализ люциферазы

Плазмиды репортерного гена люциферазы WT и мутантного (MUT) PUMA 3’UTR были созданы компанией Promega (WI, США). Затем клетки котрансфицировали миметиками miR-NC или miR-221/222 с репортерной плазмидой WT или MUT PUMA 3’UTR с использованием реагента Lipofectamine 3000.После 48-часовой инкубации при 37°C для измерения относительной активности люциферазы использовали систему анализа двойной люциферазы (Promega). Кроме того, компания Promega создала WT и MUT плазмид репортерного гена люциферазы ETS-1 3’UTR. Подобные процедуры были выполнены, как описано выше.

Аннексин V/йодид пропидия (PI) Двойное окрашивание

клеток H9c2 высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 3×10 5 клеток на лунку. После проведения различных обработок в разных группах процент апоптотических клеток определяли с помощью набора для обнаружения апоптоза (BD) Annexin V-FITC/PI в соответствии с протоколом производителя и исследовали с помощью проточного цитометра FACSCanto II (BD).Аннексин V-положительные и PI-отрицательные популяции представляют собой ранние апоптотические клетки, в то время как аннексин V-положительные и PI-положительные популяции представляют поздние апоптотические клетки. Согласно предыдущему отчету, эти популяции обычно выбирают в качестве клеток апоптоза (Xiao et al., 2016).

Статистика

Количественные данные были получены из указанного количества экспериментов и выражены как среднее ± стандартное отклонение. Различия между 2 группами рассчитывали с помощью теста Стьюдента t .Статистическую значимость различий между несколькими экспериментальными группами определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Dunnett . Для анализа данных использовали SPSS (версия 17.0; IBM, штат Нью-Йорк, США). Значение P <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Кардиопротекторные эффекты ADSC-Exo были связаны со снижением апоптоза и гипертрофии при И/Р-индуцированном повреждении сердца

В первой серии экспериментов мы исследовали, улучшает ли ADSC-Exo сердечную функцию у мышей I/R.На рисунке 1А показаны репрезентативные изображения в М-режиме от контрольных мышей, мышей, получавших I/R, и мышей, получавших ADSC-Exo I/R. Уровень КВ и ФС у животных И/Р был заметно снижен по сравнению с таковыми у контрольных животных. Напротив, EF и FS у мышей, получавших ADSC-Exo, были значительно повышены по сравнению с таковыми у мышей, получавших I/R. Высвобождение ЛДГ является индикатором повреждения клеток. Как показано на рисунке 1В, после 30-минутной ишемии миокарда с последующей реперфузией в течение 3 часов высвобождение ЛДГ в плазме в группе И/Р значительно увеличилось.ADSC-Exo значительно снижал высвобождение ЛДГ. Окислительный стресс играет решающую роль в индуцированном И/Р повреждении сердца. Поэтому мы попытались изучить влияние ADSC-Exo на продукцию АФК. Как показано на рисунке 1C, ДГЭ-положительные клетки явно присутствовали в группе I/R. ADSC-Exo значительно снизил производство АФК. Точно так же вестерн-блоттинг был использован для подтверждения того, что I / R увеличивает экспрессию HIF-1α, а ADSC-Exo снижает экспрессию HIF-1 (рис. 1D).

Рисунок 1. Лечение ADSC-Exo ослабляло индуцированный И/Р апоптоз и гипертрофию миокарда in vivo .Мышей подвергали ишемии в течение 30 мин с последующей реперфузией в течение 3 ч. В мышиной модели I/R + ADSC-Exo через 25 мин после окклюзии ADSC-Exo (100 мкг белка в 50 мкл) равномерно внутримышечно вводили в пять позиций в пограничной зоне передней стенки левого желудочка, а затем перфузировали в течение 3 час (A) Репрезентативные изображения в М-режиме от контрольных мышей, мышей, получавших I/R, и мышей, получавших ADSC-Exo I/R. Фракция выброса левого желудочка (EF) и фракционное укорочение (FS) у мышей I/R, получавших ADSC-Exo, были значительно увеличены по сравнению с мышами, получавшими I/R. (B) Уровень высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ). (C) Измерение внутриклеточных АФК с помощью окрашивания ДГЭ. Масштабная линейка, 125 мкм. Показан количественный анализ флуоресценции ДГЭ. (D) Вестерн-блот анализ уровня экспрессии HIF-1α. (E) Влияние ADSC-Exo на апоптоз после И/Р повреждения миокарда с помощью анализа TUNEL. (F) Показан количественный анализ площади поперечного сечения кардиомиоцитов с помощью окрашивания WGA. Срезы сердца окрашивали с помощью окрашивания WGA и определяли площадь поперечного сечения кардиомиоцитов.Был проведен анализ изображений клеток относительной площади поверхности клеток (размера клеток). Масштабная линейка, 50 мкм. (G) Уровни BCL2, p-p53, каспазы-3 и белка ANP оценивали с помощью вестерн-блоттинга. Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 3). * P <0,05 по сравнению с контрольной группой; P <0,05 по сравнению с группой I/R.

Затем мы исследовали наличие или отсутствие апоптоза и гипертрофии кардиомиоцитов, обработанных ADSC-Exo I/R.I/R индуцировал значительный апоптоз, в то время как ADSC-Exo снижал этот эффект, что было обнаружено с помощью анализа TUNEL (рис. 1E). Кроме того, окрашивание WGA показало, что I/R индуцирует гипертрофию клеток, в то время как ADSC-Exo уменьшает гипертрофию по сравнению с таковой в группе I/R (рис. 1F). В дополнение к прямому обнаружению апоптоза и гипертрофии кардиомиоцитов с помощью окрашивания TUNEL и WGA, дальнейшие исследования молекулярных механизмов включают обнаружение маркеров апоптоза (таких как p-p53, каспаза-3 и BCL2) и маркеров гипертрофии (таких как ANP).Как показано на рисунке 1G, лечение I / R значительно снижало уровни BCL2 и увеличивало экспрессию p-p53, каспазы-3 и ANP, в то время как лечение ADSC-Exo значительно обращало этот эффект.

ADSC-Exo защищен от И/Р-повреждения миокарда у мышей с помощью миР-221/222

Экспрессия

miR-221/222 была заметно снижена в сердцах, обработанных I/R, с помощью RT-qPCR. Введение ADSC-Exo в миокард значительно увеличивало экспрессию миР-221/222 (рис. 2А). ADSC-Exo явно присутствовали в тканях сердца (рис. 2В).Биоинформатический анализ с использованием программы прогнозирования целевых микроРНК «miRanda» показал, что PUMA и ETS-1 являются потенциальными генами-мишенями для miR-221/222. В частности, 3′-UTR мРНК PUMA и мРНК ETS-1 содержат предполагаемые сайты связывания miR-221/222. Двойной репортерный анализ люциферазы подтвердил, что миР-221/222 нарушала люциферазную активность 3′-UTR PUMA и 3′-UTR ETS-1 (WT) дикого типа, но не 3′-UTR MUT PUMA и ETS-1 в клетки (рис. 2C). Как показано на рисунке 2D, окрашивание PUMA и ETS-1 не наблюдалось с помощью иммуногистохимии в контрольной группе, тогда как сильное окрашивание наблюдалось на тканях сердца в группе лечения I/R.Напротив, введение ADSC-Exo приводило к более слабому окрашиванию PUMA и ETS-1 у мышей, получавших I/R. Точно так же данные были дополнительно подтверждены вестерн-блоттингом (рис. 2Е). Результаты показали, что уровни белка PUMA и ETS-1 повышались при обработке И/Р, в то время как ADSC-Exo уменьшал экспрессию в ответ на И/Р.

Рис. 2. ADSC-Exo защищает от И/Р повреждения миокарда у мышей с помощью миР-221/222. Мышей подвергали ишемии в течение 30 мин с последующей реперфузией в течение 3 ч.На модели мышей I/R+ADSC-Exo через 25 мин после окклюзии ADSC-Exo (100 мкг белка в 50 мкл) равномерно внутримышечно вводили в пограничную зону передней стенки левого желудочка в пяти точках с последующим реперфузия в течение 3 часов. (A) Уровни miR-221/222 определяли с помощью RT-qPCR. (B) ADSC-Exo, меченный PKH-26 (красный), присутствовал в тканях сердца. (C) Потенциальные сайты связывания miR-221/222 в 3′-UTR мРНК PUMA и ETS-1. Анализ активности люциферазы при котрансфекции 3’UTR PUMA дикого типа (PUMA-WT) или 3’UTR PUMA мутантного типа (PUMA-MUT) с миметиками miR-221/222 или отрицательным контролем (скремблирование).Кроме того, анализ активности люциферазы клеток, котрансфицированных 3′-UTR ETS-1 дикого типа (ETS-1-WT) или 3′-UTR ETS-1 мутантного типа (ETS-1-MUT) с миметиками miR-221/222 или отрицательный контроль (скрембл). (D) Экспрессия PUMA и ETS-1 в тканях сердца, обнаруженная с помощью иммуногистохимии. Положительный продукт реакции обозначался коричневой окраской. Ядра докрашивали раствором гематоксилина. (E) Вестерн-блот анализ уровней экспрессии PUMA и ETS-1.Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 3). GAPDH использовали в качестве контроля. * P < 0,05 по сравнению с контрольной группой; P <0,05 по сравнению с группой I/R.

ADSC-Exo снижает апоптоз и гипертрофию в клетках H9c2

2 O 2 -обработанные клетки H9c2

Чтобы лучше понять защитный механизм ADSC-Exo от повреждения миокарда I/R, кардиомиоциты H9c2, обработанные H 2 O 2 , использовали для имитации повреждения миокарда I/R in vitro .Хорошо известно, что окислительный стресс является важным фактором, вызывающим апоптоз и гипертрофию кардиомиоцитов (Tsutsui et al., 2011). Клетки H9c2 подвергались воздействию различных концентраций H 2 O 2 от 25 до 400 мкМ, и H 2 O 2 снижала жизнеспособность клеток в зависимости от концентрации (данные не показаны). Меченые РХ36 экзосомы поглощались клетками H9c2 (рис. 3А). Клетки H9c2, обработанные 50 мкМ H 2 O 2 в течение 24 ч, увеличивали продукцию АФК, в то время как ADSC-Exo значительно снижала продукцию АФК согласно анализу DCFDA (рис. 3В).Кроме того, уровни апоптоза были обнаружены путем окрашивания аннексином V/PI с помощью проточной цитометрии (рис. 3C). H 2 O 2 вызывал усиление апоптоза, тогда как ADSC-Exo уменьшал апоптоз. Апоптоз был дополнительно подтвержден анализом TUNEL, и лечение ADSC-Exo уменьшило апоптоз, индуцированный H 2 O 2 (рис. 3D). Кроме того, H 2 O 2 вызывал гипертрофию клеток, тогда как обработка ADSC-Exo снижала гипертрофию клеток (рис. 3E). Поскольку обработка ADSC-Exo увеличивала экспрессию miR-221/222 в сердцах, обработанных I/R, мы оценили, защищает ли miR-221/222 кардиомиоциты от H 2 O 2 , индуцированных апоптозом и гипертрофией.Согласно результатам RT-qPCR, уровни miR-221/222 были значительно снижены в группе лечения H 2 O 2 по сравнению с контрольной группой, в то время как ADSC-Exo увеличивал экспрессию miR-221/222 (рис. 3F). . Кроме того, по сравнению с ADSC, ADSC-Exo содержит большое количество миР-221 и миР-222 (рис. 3G). Для дальнейшего изучения вовлеченных молекулярных механизмов были измерены уровни экспрессии апоптотических белков и маркеров гипертрофии (таких как p-p53, BCL2 и ANP).Как показано на рисунке 3H, лечение H 2 O 2 значительно повышало уровни p-p53 и ANP и снижало уровни BCL2, в то время как присутствие ADSC-Exo значительно ослабляло повышение уровней p-p53. и АНП. Кроме того, вестерн-блоттинг показал, что обработка H 2 O 2 может повышать уровни экспрессии PUMA и ETS-1. Напротив, ADSC-Exo снижал экспрессию. В совокупности эти данные показывают, что введение ADSC-Exo приводит к снижению апоптоза и гипертрофии, индуцированных H 2 O 2 .Эти результаты показывают, что миР-221/222 является эффективным регулятором апоптоза и гипертрофии кардиомиоцитов.

Рисунок 3. ADSC-Exo ослаблял H 2 O 2 -индуцированный апоптоз и гипертрофию путем подавления экспрессии PUMA и ETS-1 в клетках H9c2. Кардиомиоциты предварительно обрабатывали ADSC-Exos (2 мкг/мл) или без него в течение 4 часов, а затем подвергали воздействию 50 мкМ H 2 O 2 в течение 48 часов. (А) Экзосомы, меченные РХ36 (красные), были поглощены клетками H9c2.Синий цвет представляет ядро ​​клетки. Масштабная линейка, 100 мкм. (B) H 2 O 2 увеличивал продукцию ROS, в то время как ADSC-Exo значительно снижал продукцию ROS согласно анализу DCFDA. Зеленый цвет представляет ROS-положительные клетки. Масштабная линейка, 100 мкм. (C) Анализ апоптотических клеток методом проточной цитометрии с окрашиванием аннексином V/PI. (D) Апоптоз исследовали с помощью анализа TUNEL. Зеленые, TUNEL-положительные ядра; синий, ядра. Показан количественный анализ гибели клеток.Обработка ADSC-Exo уменьшала апоптоз, индуцированный H 2 O 2 . Масштабная линейка, 100 мкм. (E) H 2 O 2 вызывали гипертрофию клеток, а обработка ADSC-Exo уменьшала гипертрофию клеток при наблюдении с помощью инвертированного микроскопа. Показан количественный анализ площади поверхности клеток. Масштабная линейка, 50 мкм. (F) По сравнению с таковыми в контрольной группе уровни миР-221/222 в группе лечения H 2 O 2 были значительно снижены, на что указывает RT-qPCR, в то время как ADSC-Exo увеличивал экспрессию . (G) Уровни miR-221/222 в ADSC были значительно выше, чем в клетках H9c2. Важно отметить, что уровни миР-221/222 в ADSC-Exo были значительно выше, чем в ADSC. клетки. (H) Уровни маркеров апоптоза (p-p53, BCL2 и PUMA) и маркеров гипертрофии (ETS-1 и ANP) исследовали вестерн-блоттингом. GAPDH использовали в качестве контроля загрузки. Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 3). * P < 0,05 против.контрольная группа; P < 0,05 по сравнению с H 2 O 2 .

миР-221/222 участвовала в ADSC-экзо-опосредованном ингибировании апоптоза и гипертрофии в H

2 O 2 — Обработанные кардиомиоциты

Чтобы продемонстрировать влияние миР-221/222 на апоптоз и гипертрофию, уровни экспрессии маркера апоптоза PUMA и маркера гипертрофии ETS-1 измеряли в кардиомиоцитах, трансфицированных миметиками миР-221/222. Миметики miR-221/222 значительно снижали экспрессию PUMA и повышали экспрессию BCL2 в кардиомиоцитах, обработанных H 2 O 2 (фиг. 4A).Анализ TUNEL, оцененный с помощью флуоресцентной микроскопии или проточной цитометрии, и окрашивание аннексина V/PI, оцененное с помощью проточной цитометрии, показали, что трансфекция миметиками miR-221/222 также значительно снижает апоптоз, индуцированный H 2 O 2 , по сравнению с таковым в контрольной группе. (Рисунки 4B-D). Индуцированный апоптоз Нокдаун PUMA в клетках H9c2, подвергшихся воздействию H 2 O 2 , значительно увеличивал экспрессию BCL2 и снижал апоптоз (рис. 4A–E). Кроме того, миметики miR-221/222 значительно снижали экспрессию ETS-1 в кардиомиоцитах, обработанных H 2 O 2 (рис. 4F).Более того, трансфекция миметиком miR-221/222 также значительно снижала гипертрофию, индуцированную H 2 O 2 , посредством экспрессии ANP и проточной цитометрии (Рисунки 4F, G). Нокдаун ETS-1 в клетках H9c2, подвергшихся воздействию H 2 O 2 , снижал экспрессию ANP и гипертрофию клеток (рис. 4G, H). Сверхэкспрессия PUMA была подтверждена иммунофлуоресцентным окрашиванием, а трансфекция миметиков miR-221/222 снижала экспрессию PUMA (рис. 4I). Анализ TUNEL показал, что трансфекция миметиков miR-221/222 снижает апоптоз, индуцированный сверхэкспрессией PUMA (рис. 4I, J).Сверхэкспрессия ETS-1 также была подтверждена иммунофлуоресцентным окрашиванием, которое показало, что трансфекция миметиков miR-221/222 снижает экспрессию ETS-1 (рис. 4K). Трансфекция миметиком miR-221/222 снижала гипертрофию, вызванную сверхэкспрессией ETS-1, по сравнению с таковой в контрольной группе (рис. 4K, L). Следовательно, эти результаты показывают, что miR-221/222 регулирует экспрессию PUMA и ETS-1, которые участвуют в апоптозе и гипертрофии.

Рисунок 4. miR-221/222 участвовала в ADSC-Exo-опосредованном ингибировании H 2 O 2 -индуцированного апоптоза и гипертрофии кардиомиоцитов.Клетки H9c2 трансфицировали миметиками miR-221/222 или siRNA, нацеленными на PUMA и ETS-1, в течение 48 часов, а затем подвергали воздействию 50 мкМ H 2 O 2 в течение 48 часов. (A) Вестерн-блот-анализ уровней белков PUMA и BCL2 с использованием миметиков miR-221/222 или миРНК PUMA. (B–D) Трансфекция миметиками miR-221/222 или миРНК PUMA значительно снижала апоптоз, индуцированный H 2 O 2 , по данным анализа TUNEL с использованием флуоресцентной микроскопии (B) или проточной цитометрии ( C) и окрашивание аннексином V/PI с использованием проточной цитометрии (D) . (E) Нокдаун PUMA в клетках H9c2, подвергшихся воздействию H 2 O 2 , увеличивал экспрессию BCL2 и снижал апоптоз. (F) Миметики miR-221/222 значительно снижали экспрессию ETS-1 и ANP в кардиомиоцитах, обработанных H 2 O 2 . (G) Трансфекция миметиками miR-221/222 также значительно снижала гипертрофию, индуцированную H 2 O 2 , по данным проточной цитометрии. Прямое рассеяние (FSC) представляет размер ячейки. (H) Нокдаун ETS-1 в клетках H9c2, подвергшихся воздействию H 2 O 2 , снижал экспрессию ANP с помощью вестерн-блоттинга. (I) Сверхэкспрессия PUMA была подтверждена иммунофлуоресцентным окрашиванием, а трансфекция миметиками miR-221/222 снижала экспрессию PUMA. (J) Апоптоз, индуцированный сверхэкспрессией PUMA, согласно анализу TUNEL, в то время как трансфекция имитаторами miR-221/222 снижала апоптоз. (K) Сверхэкспрессия ETS-1 была подтверждена иммунофлуоресцентным окрашиванием, а трансфекция миметиками miR-221/222 снижала экспрессию ETS-1. (L) Сверхэкспрессия ETS-1 индуцировала гипертрофию, в то время как трансфекция миметиками miR-221/222 обращала этот эффект.Показан количественный анализ площади поверхности клеток. Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 3). * P <0,05 по сравнению с контрольной (нелеченой) группой; P < 0,05 по сравнению с H 2 O 2 .

ADSC-Exo снижает апоптоз и гипертрофию в H

2 O 2 -Обработанные клетки H9c2 через путь AKT/NFκB

Появляется все больше доказательств того, что AKT/NFκB играет критическую роль в апоптозе и гипертрофии (Zhao et al., 2015; Луо и др., 2019). Кардиомиоциты культивировали отдельно или обрабатывали H 2 O 2 . По сравнению с контрольными клетками клетки H9c2, обработанные H 2 O 2 , снижали уровни фосфорилированной AKT, в то время как клетки, обработанные ADSC-Exo, увеличивали экспрессию p-AKT (фиг. 5A). Трансфекция миметиков miR-221/222 также значительно увеличивала H 2 O 2 -восстановленное фосфорилирование AKT (фиг. 5B). Чтобы выяснить, необходима ли активация пути AKT для воздействия ADSC-Exo на апоптоз и гипертрофию клеток H9c2, обработанных H 2 O 2 , во время лечения H 2 O 2 использовали активатор AKT SC79. .SC79 снижал H 2 O 2 -индуцированную экспрессию PUMA и ETS-1 в клетках H9c2 (рис. 5C, D). Кроме того, также исследовали экспрессию NFκB в клетках H9c2, обработанных H 2 O 2 . Как показано на фигуре 5E, H 2 O 2 увеличивало фосфорилирование NFκB p65 по сравнению с таковым в контрольных клетках, тогда как ADSC-Exo снижало экспрессию p-p65. Трансфекция миметиков miR-221/222 также значительно снижала увеличение фосфорилирования p65 с помощью H 2 O 2 (рис. 5F).Чтобы подтвердить роль NFκB в индуцированных ADSC-Exo антиапоптотических и антигипертрофических эффектах в клетках H9c2, клетки обрабатывали H 2 O 2 с ингибитором NFκB Bay 11-7082 или без него (Bay 11). Как показано на фиг. 5G, H, ингибитор NFκB снижал экспрессию PUMA и ETS-1 в обработанных H 2 O 2 клетках H9c2. Анализ TUNEL и окрашивание WGA, оцениваемые с помощью флуоресцентной микроскопии, показали, что лечение активатором AKT или ингибитором NFκB также снижает апоптоз и гипертрофию кардиомиоцитов, обработанных H 2 O 2 (рис. 5I, J).SC79 снижал фосфорилирование NFκB, в то время как Bay 11 не влиял на фосфорилирование AKT (рис. 5K, L). Кроме того, по сравнению с контрольным лечением лечение I/R значительно снижало p-AKT и увеличивало p-p65 по сравнению с тем, что ADSC-Exo обращал эти эффекты in vivo (рис. 5M, N). Лечение активатором AKT или ингибитором NFκB также снижало экспрессию PUMA и ETS-1 у мышей, получавших I/R (рис. 5O, P). В совокупности эти данные указывают на то, что ADSC-Exo с miR-221/222 предотвращает сердечное повреждение I / R через путь AKT / NFκB.

Рис. 5. ADSC-Exo снижает апоптоз и гипертрофию в клетках H9c2, обработанных H 2 O 2 , посредством пути AKT/NFκB. Кардиомиоциты предварительно обрабатывали ADSC-Exos (2 мкг/мл) или без него в течение 4 часов, а затем подвергали воздействию 50 мкМ H 2 O 2 в течение 48 часов. (A) Влияние на AKT исследовали в клетках H9c2, обработанных H 2 O 2 . H 2 O 2 снижал фосфорилирование AKT по сравнению с таковым в контрольных клетках, в то время как ADSC-Exo увеличивал экспрессию AKT, как показывает вестерн-блоттинг. (B) Трансфекция миметиков miR-221/222 значительно улучшила H 2 O 2 -снижение фосфорилирования AKT. (C,D) Предварительная обработка SC79 (10 мкМ) в течение 1 ч снижала H 2 O 2 -индуцированную экспрессию PUMA и ETS-1 в клетках H9c2. (E) Экспрессию NFκB в клетках H9c2, обработанных H 2 O 2 , исследовали с помощью вестерн-блоттинга. H 2 O 2 увеличивал фосфорилирование NFκB p65 по сравнению с таковым в контрольных клетках, тогда как ADSC-Exo снижал экспрессию p-p65. (F) Трансфекция миметиков miR-221/222 значительно снижала повышенное фосфорилирование p65 с помощью H 2 O 2 . (G, H) Предварительная обработка ингибитором NFκB (Bay 11, 2,5 мкМ) в течение 1 ч снижала H 2 O 2 -индуцированную экспрессию PUMA и ETS-1 в клетках H9c2. (I,J) Предварительная обработка SC79 или Bay 11 в течение 1 часа уменьшала апоптоз и гипертрофию в кардиомиоцитах, обработанных H 2 O 2 , что было обнаружено с помощью анализа TUNEL и окрашивания WGA соответственно.Показан количественный анализ TUNEL-положительных клеток или площади клеточной поверхности. (K,L) SC79 уменьшал фосфорилирование NFκB, в то время как Bay 11 не влиял на фосфорилирование AKT. (M, N) И/Р лечение значительно снижало p-AKT и повышало p-p65 по сравнению с таковым у контрольных мышей, в то время как ADSC-Exo обращал эти эффекты in vivo . (O,P) У мышей, получавших SC79 (10 мг/кг) или Bay 11 (80 мг/кг), наблюдалось снижение экспрессии PUMA и ETS-1 у мышей, получавших I/R.Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 3). * P <0,05 по сравнению с контролем; P < 0,05 по сравнению с H 2 O 2 .

ADSC-Exo защищает от повреждения I/R миокарда у мышей miR-221/222 KO

Наблюдалось значительное увеличение экспрессии PUMA и ETS-1 после обработки I/R у мышей miR-221/222 KO, а ADSC-Exo ослаблял индуцированную I/R активацию PUMA и ETS-1 (рис. 6A, B). ). Кроме того, лечение ADSC-Exo уменьшало апоптоз и гипертрофию в кардиомиоцитах, на что указывал анализ TUNEL и окрашивание WGA, соответственно, у мышей miR-221/222 KO, получавших I/R (рис. 6B-D).В соответствии с результатами лечения ADSC-Exo трансфекция миР-221/222 значительно снижала апоптоз в соответствии с анализом TUNEL и гипертрофию в соответствии с окрашиванием WGA по сравнению с таковым в группе I/R (рис. 6E). Кроме того, уровни PUMA и ETS-1 в группе I/R повышались, в то время как уровни в группе I/R + mimic-miR-221/222 восстанавливались (рис. 6F). Точно так же этот результат был подтвержден с помощью иммуногистохимии (рис. 6G). Напротив, в группе ингибиторов I/R+ADSC-Exo+miR-221/222 не наблюдалось снижения апоптоза и гипертрофии по сравнению с группой I/R (рис. 6H).Экспрессия PUMA и ETS-1 повышалась в группе I/R, и на нее не влияла группа ингибиторов I/R+ADSC-Exo+ miR-221/222 (рис. 6I). Результаты были подтверждены иммуногистохимией (рис. 6J). Эти данные убедительно подтверждают, что ADSC-Exo может предотвращать I/R повреждение миокарда посредством miR-221/222 in vivo .

Рис. 6. ADSC-Exo оказывает защитное действие на повреждение миокарда I/R у мышей miR-221/222 KO. Мышей miR-221/222 KO подвергали ишемии в течение 30 минут с последующей реперфузией в течение 3 часов.В модели мышей miR-221/222 KO, обработанных I/R + ADSC-Exo, через 25 мин после окклюзии ADSC-Exo (100 мкг белка в 50 мкл), миметики или ингибиторы miR-221/222 (50 пмоль в 50 мкл). мкл) вводили внутримышечно равномерно в пограничную зону передней стенки левого желудочка в пяти позициях с последующей реперфузией в течение 3 ч. (A) Уровни белка PUMA и ETS-1 оценивали с помощью вестерн-блоттинга. (B) Влияние ADSC-Exo на экспрессию PUMA и ETS-1 у мышей miR-221/222 KO. (C, D) Эффекты ADSC-Exo на апоптоз и гипертрофию исследовали с помощью анализа TUNEL и окрашивания WGA, соответственно, у мышей miR-221/222 KO. Показаны результаты количественного анализа TUNEL-положительных клеток или площади клеточной поверхности. (E) Влияние трансфекции миметиков miR-221/222 на апоптоз и гипертрофию исследовали с помощью анализа TUNEL и окрашивания WGA, соответственно, у мышей WT и miR-221/222 KO. Показан количественный анализ TUNEL-положительных клеток или площади клеточной поверхности. (F, G) Влияние трансфекции миметиков miR-221/222 на экспрессию PUMA и ETS-1 исследовали с помощью вестерн-блоттинга и иммуногистохимии у мышей WT и miRNA-221/222 KO. (H) Влияние трансфекции ингибиторов миР-221/222 на апоптоз и гипертрофию исследовали с помощью анализа TUNEL и окрашивания WGA, соответственно, у мышей дикого типа. Показаны результаты количественного анализа TUNEL-положительных клеток и площади клеточной поверхности. (I,J) Влияние трансфекции ингибиторов миР-221/222 на экспрессию PUMA и ETS-1 исследовали вестерн-блоттингом и иммуногистохимией на мышах дикого типа.Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 3). Коричневый цвет: апоптотические клетки; синий цвет: ядра. Красный или зеленый цвет: граница ячейки. * P < 0,05 по сравнению с контрольной группой; P <0,05 по сравнению с группой I/R. Масштабная линейка, 50 мкм.

Обсуждение

Апоптоз и гипертрофия кардиомиоцитов являются важными компонентами И/Р-индуцированного повреждения сердца. В этом исследовании мы обнаружили, что миокардиальный апоптоз и экспрессия белка, связанного с гипертрофией, увеличивались после лечения И/Р.Однако лечение экзосомами из ADSC обратило эти эффекты вспять. Мы также продемонстрировали, что кардиозащитные эффекты достигаются за счет большого количества миР-221/222, нацеленного на белки PUMA и ETS-1.

Потеря кардиомиоцитов во время И/Р миокарда в основном связана с гибелью клеток и ишемическим стрессом в выживших миоцитах, что запускает ремоделирование левого желудочка и приводит к гипертрофии (Konstantinidis et al., 2012). Гибель клеток в первую очередь вызывается апоптозом и некрозом. Кроме того, гипертрофия сердца характеризуется увеличением размеров отдельных кардиомиоцитов.Хотя изначально гипертрофия считалась компенсаторной реакцией на баланс давления стенки во время систолы, появляется все больше экспериментальных данных о том, что гипертрофия активирует дезадаптивные клеточные процессы и способствует прогрессированию заболевания (Bisping et al., 2014). Действительно, гипертрофия сердца является мощным и независимым фактором риска неблагоприятного прогноза сердечно-сосудистых заболеваний (Hawkins et al., 2007). Поскольку кардиомиоциты окончательно дифференцированы и имеют небольшой потенциал для деления, снижение апоптоза и гипертрофии кардиомиоцитов после повреждения имеет потенциальную терапевтическую ценность (Brown and Griendling, 2015).Предыдущие исследования показали, что PUMA и ETS-1 способствуют апоптозу и гипертрофии кардиомиоцитов соответственно (Zhou et al., 2016; Li Y. et al., 2017). Несколько исследователей предложили различные пути апоптоза кардиомиоцитов путем активации PUMA, p53-чувствительного белка Bh4 (Yang et al., 2014, 2019). Отсутствие PUMA уменьшало размер инфаркта изолированных перфузируемых сердец, получавших И/Р (Toth et al., 2006). Абляция PUMA ослабляла сердечную дисфункцию в модели сердечной недостаточности у мышей за счет уменьшения апоптоза (Mandl et al., 2011). Подавление PUMA может ингибировать апоптоз in vivo и защищать от неонатального гипоксически-ишемического повреждения головного мозга. Кроме того, патологический процесс гипертрофии кардиомиоцитов тесно связан с экспрессией ETS-1. Инфузия Ang II вызывала увеличение размера сердца и толщины стенки желудочка у мышей, но эти эффекты были значительно уменьшены у мышей с глобальным нокаутом ETS-1 (Zhan et al., 2005; Xu et al., 2019). Наше текущее исследование показывает, что добавление H 2 O 2 к культивируемым кардиомиоцитам может повысить уровни PUMA и ETS-1, а ингибирование PUMA и ETS-1 может уменьшить апоптоз и гипертрофию соответственно.Мы также показываем, что I / R увеличивает миокардиальный апоптоз и гипертрофию с помощью окрашивания TUNEL и WGA соответственно. Более того, лечение И/Р значительно снижает уровень BCL2 и увеличивает экспрессию p-p53, каспазы-3, PUMA (маркеры апоптоза), ANP и ETS-1 (маркеры гипертрофии), в то время как лечение ADSC-Exo значительно обращает этот эффект. ADSC-Exo уменьшает апоптоз и гипертрофию и может быть полезен при повреждениях, вызванных И/Р.

Мезенхимальные стволовые клетки больше подходят для лечения ишемических заболеваний, поскольку они связаны с меньшим количеством этических проблем, более высокой способностью к самообновлению и более низкой иммуногенностью.В наших исследованиях ранее сообщалось о потенциальной эффективности мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека при восстановлении повреждения сосудов (Wang et al., 2009; Shen et al., 2013; Liang et al., 2015). Кроме того, ADSC привлекательны тем, что их легко получить, они быстро размножаются in vitro и могут быть собраны из большого количества жировой ткани. Важно отметить, что недавнее исследование показало, что наблюдаемые терапевтические эффекты в первую очередь опосредованы секрецией стволовых клеток (Harrell et al., 2019).Экзосомы являются наиболее эффективными активными паракринными компонентами, играют важную роль в межклеточных коммуникациях и обладают большим потенциалом для восстановления поврежденных тканей (Lai et al., 2010). Экзосомы несут сложные микроРНК и белки и могут влиять на многие клеточные процессы и пути (Théry et al., 2009). Прошлые исследования показали, что экзосомы, полученные из МСК, играют ключевую роль в защите от повреждения сердца и почек, вызванного И/Р (Lin et al., 2016; Zhang et al., 2016). Кроме того, экзосомы потенциально безопаснее, поскольку их применение осуществимо и снизит затраты на производство и хранение.ADSC-Exo играет полезную роль, увеличивая миграцию эндотелиальных клеток пупочной вены человека и формируя капиллярные сети in vitro (Han et al., 2018). Наше предыдущее исследование показало, что лечение ADSC-Exo увеличивает выживаемость лоскута и плотность капилляров по сравнению с таковым при И/Р через путь IL-6 (Pu et al., 2017). Другое исследование также показало, что ADSC-Exo защищает миокард от повреждения I/R посредством пути Wnt/β-catenin (Cui et al., 2017). Мы обнаружили, что ADSC-Exo может поглощаться и интернализоваться кардиомиоцитами для ингибирования апоптоза и гипертрофии за счет снижения экспрессии PUMA и ETS-1 в культивируемых кардиомиоцитах, обработанных H 2 O 2 , и мышах, получавших I/R.Основываясь на этих выводах, ADSC-Exo можно использовать для терапевтического регулирования функции кардиомиоцитов.

О нарушении регуляции экспрессии микроРНК сообщалось в многочисленных исследованиях, затрагивающих различные патофизиологические процессы, включая И/Р и сердечную недостаточность (Barraclough et al., 2019). В этих исследованиях ранее сообщалось, что miR-221/222 играет важную роль в воспалении, сердечно-сосудистой функции и тканевом метаболизме (Chistiakov et al., 2015; Song et al., 2017; Verjans et al., 2018).miR-221/222 очень распространена в ADSC-Exo и будет выбрана для дальнейших исследований. miR-221 и miR-222 являются высоко гомологичными микроРНК, кодируемыми на Х-хромосоме, и образуют кластеры miR-221-222 (Song et al., 2017). По сравнению со здоровым контролем экспрессия miR-221-3p и miR-222-3p была значительно снижена у пациентов с атеросклерозом, что позволяет предположить, что подавление этих двух микроРНК может быть связано с атеросклеротическим процессом (Zhang et al., 2014). Аро Е регулирует экспрессию р27 посредством миР-221/222, что ограничивает пролиферацию гладкомышечных клеток (Kothapalli et al., 2013). Экспрессия мРНК ICAM-1 увеличивается, в то время как экспрессия miR-221 снижается в аорте и сердце (Duan et al., 2013). Системное ингибирование miR-221/222 in vivo приводит к тяжелому поражению сердца, увеличению вирусной нагрузки на сердце и длительной виремии при вирусном миокардите (Corsten et al., 2015). Используя предсказания биоинформатики, сайты комплементарного связывания miR-221/222 были идентифицированы в 3′-UTR мРНК PUMA и мРНК ETS-1, которые обладают антиапоптотическими и антигипертрофическими свойствами соответственно.Сверхэкспрессия miR-221/222 в глиобластоме индуцирует выживание клеток, тогда как нокдаун этих miR приводит к усилению апоптоза путем активации PUMA (Zhang et al., 2010). В этом исследовании мы обнаружили, что условия I/R или H 2 O 2 снижают уровни экспрессии miR-221/222. Лечение экзосомами, содержащими большое количество миР-221/222, или трансфекция миР-221/222 значительно снижала экспрессию PUMA и ETS-1, что свидетельствует о том, что ADSC-Exo может уменьшать индуцированное I/R повреждение миокарда путем подавления PUMA и ETS-1. 1.Мы продемонстрировали, что miR-221/222 может действовать как вышестоящий регулятор PUMA и ETS-1, тем самым регулируя клеточные апоптотические и гипертрофические процессы.

Патогенез повреждения сердца включает множественные внутриклеточные сигнальные каскады, включая пути ROS, AKT и фактора транскрипции (NF-kB) (Ma et al., 2014). Учитывая участие ADSC-Exo в снижении индуцированного I/R апоптоза и гипертрофии, регулирование этих сигналов имеет большое значение. Сигнальный путь AKT играет важную роль в предотвращении повреждения I/R, регулируя проапоптотические сигналы, воспаление и АФК (Li Q.и др., 2019). Апоптоз клеток, вызванный окислительным стрессом, обусловлен дисфункцией AKT и активацией NFκB (Wang et al., 2019). JNK/NFκB участвует в миокардиальном I/R-индуцированном апоптозе (Zhang et al., 2019). TNF-α активирует NF-κB посредством образования АФК и пути AKT, чтобы предотвратить гибель кардиомиоцитов (Tang et al., 2018). Было показано, что ингибитор NFκB Bay 11-7082 ингибирует ремоделирование левого желудочка после ИМ (Wang et al., 2017). Другое исследование подтвердило, что фосфорилирование AKT было значительно снижено в сердце мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров, после травмы I/R (Samidurai et al., 2019). Эффект экспрессии AKT и p-p65 считается потенциальной терапевтической мишенью при сердечном и/р повреждении (Yuan et al., 2015). В соответствии с некоторыми из этих предыдущих исследований, p-AKT был снижен, а p-p65 повышен в клетках H9c2, обработанных H 2 O 2 , и в сердцах, обработанных I/R, в настоящем исследовании. Мы также продемонстрировали, что активатор AKT и ингибитор NF-κB значительно снижают экспрессию PUMA и клеточный апоптоз. Они также снижали экспрессию ETS-1 и гипертрофию клеток.Предыдущие исследования показали, что продукция цитокинов, регулируемая микроРНК, опосредована модулированием AKT/NF-κB (Zhao et al., 2019). miRNA-29a регулирует липополисахарид-индуцированные воспалительные реакции в мышиных макрофагах посредством пути Akt1/NF-κB (Tang et al., 2017). миР-221/222 способствует свойствам раковых стволовых клеток и росту опухоли рака молочной железы путем нацеливания на PTEN и поддержания активации Akt/NF-κB/COX-2 (Li B. et al., 2017). Кроме того, настоящее исследование продемонстрировало, что введение экзогенного ADSC-Exo и трансфекция миметиков miR-221/222 могут активировать передачу сигналов AKT и снижать экспрессию NF-κB для обеспечения защиты.Таким образом, наши результаты показывают, что ADSC-Exo с миР-221/222 играет критическую роль в предотвращении сердечного I/R-индуцированного апоптоза и гипертрофии путем нацеливания на PUMA и ETS-1. Этот защитный эффект опосредуется через путь AKT/NFκB.

I/R повреждение миокарда приводит к апоптозу и гипертрофии. Мы демонстрируем, что экзосомы, секретируемые ADSC, играют положительную роль в облегчении травм I/R. Наши результаты показывают, что ADSC-Exo может уменьшить повреждение, вызванное I / R, через ось miR-221 / miR-222 / PUMA / ETS-1.Эти данные обеспечивают убедительные доказательства того, что ADSC-Exo имеет широкие перспективы для клинического применения при травмах I/R.

Заявление о доступности данных

Необработанные данные, подтверждающие выводы этой статьи, будут предоставлены авторами без неоправданных оговорок.

Заявление об этике

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Учебным комитетом по уходу и использованию животных Медицинского колледжа Национального Тайваньского университета (номер утверждения IACUC: 20150502).

Вклад авторов

T-CL, T-LL, Y-CCha и Y-CChe: концепция и дизайн, сбор и/или сбор данных, анализ и интерпретация данных и окончательное утверждение рукописи. S-RL, S-WL, C-MP и J-ST: предоставление учебного материала и окончательное утверждение рукописи. Y-LC: концепция и дизайн, финансовая поддержка, анализ и интерпретация данных, написание рукописи и окончательное утверждение рукописи. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Это исследование было поддержано исследовательским грантом Министерства науки и технологий Тайваня (MOST 105-2320-B-002-043-MY3).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы поблагодарили Shu-Mei Lai и Horng-Tzer Shy за техническую помощь в проведении эксперимента TEM.

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2020.569150/full#supplementary-material

.

Ссылки

Барраклаф, Дж. Ю., Джоан, М., Джоглекар, М. В., Хардикар, А. А., и Патель, С. (2019). МикроРНК как прогностические маркеры у пациентов с острым коронарным синдромом — систематический обзор. Ячейки 8:1572. doi: 10.3390/cells8121572

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Биспинг, Э., Вакула, П., Потесер, М., и Хайнцель, Ф.Р. (2014). Ориентация на сердечную гипертрофию: к причинной терапии сердечной недостаточности. Дж. Кардиовасц. Фармакол. 64, 293–305. DOI: 10.1097/fjc.00000000000000126

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Браун, Д. И., и Гриндлинг, К. К. (2015). Регуляция передачи сигнала активными формами кислорода в сердечно-сосудистой системе. Обр. Рез. 116, 531–549. doi: 10.1161/circresaha.116.303584

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чистяков Д.А., Собенин И.А., Орехов А.Н., Бобрышев Ю.В. (2015). МиР-221/222 человека при физиологическом и атеросклеротическом ремоделировании сосудов. Биомед. Рез. Междунар. 2015:354517. дои: 10.1155/2015/354517

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Corsten, M.F., Heggermont, W., Papageorgiou, A.P., Deckx, S., Tijsma, A., Verhesen, W., et al. (2015). Кластер микроРНК-221/-222 уравновешивает противовирусный и воспалительный ответ при вирусном миокардите. евро. Харт Дж. 36, 2909–2919. doi: 10.1093/eurheartj/ehv321

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Цуй, X., Хэ, З., Лян, З., Чен, З., Ван, Х., и Чжан, Дж. (2017). Экзосомы из мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани, защищают миокард от ишемии/реперфузии посредством сигнального пути Wnt/β-catenin. Дж. Кардиовасц. Фармакол. 70, 225–231. doi: 10.1097/fjc.0000000000000507

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Дхалла, Н.С., Эльмоселхи, А.Б., Хата, Т., и Макино, Н. (2000). Статус антиоксидантов миокарда при ишемически-реперфузионном повреждении. Кардиовасц. Рез. 47, 446–456. doi: 10.1016/s0008-6363(00)00078-x

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Дуань, М., Яо, Х., Ху, Г., Чен, X., Лунд, А. К., и Бух, С. (2013). Tat ВИЧ индуцирует экспрессию ICAM-1 в HUVEC: последствия для миР-221/-222 при ВИЧ-ассоциированной кардиомиопатии. PLoS One 8:e60170. doi: 10.1371/журнал.пон.0060170

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Эгучи С., Такефудзи М., Сакагути Т., Исихама С., Мори Ю., Цуда Т. и др. (2019). Кардиомиоциты захватывают полученную из стволовых клеток антиапоптотическую микроРНК-214 посредством клатрин-опосредованного эндоцитоза при остром инфаркте миокарда. Дж. Биол. хим. 294, 11665–11674. doi: 10.1074/jbc.RA119.007537

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хан Ю.Д., Бай Ю., Yan, X.L., Ren, J., Zeng, Q., Li, X.D., et al. (2018). Совместная трансплантация экзосом, полученных из предварительно кондиционированных гипоксией жировых мезенхимальных стволовых клеток, способствует неоваскуляризации и выживанию трансплантата при пересадке жира. Биохим. Биофиз. Рез. коммун. 497, 305–312. doi: 10.1016/j.bbrc.2018.02.076

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Харрелл, Ч.Р., Феллабаум, К., Йовичич, Н., Джонов, В., Арсениевич, Н., и Воларевич, В. (2019). Молекулярные механизмы, ответственные за терапевтический потенциал секретома, полученного из мезенхимальных стволовых клеток. Ячейки 8:467. doi: 10.3390/cells8050467

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Hawkins, N.M., Wang, D., Mcmurray, J.J., Pfeffer, M.A., Swedberg, K., Granger, C.B., et al. (2007). Распространенность и прогностические последствия электрокардиографической гипертрофии левого желудочка при сердечной недостаточности: данные программы CHARM. Сердце 93, 59–64. doi: 10.1136/hrt.2005.083949

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хойш, Г.и Герш, Б.Дж. (2017). Патофизиология острого инфаркта миокарда и стратегии защиты после реперфузии: постоянная проблема. евро. Heart J. 38, 774–784. doi: 10.1093/eurheartj/ehw224

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Heusch, G., Kleinbongard, P., and Skyschally, A. (2013). Инфаркт миокарда и коронарная микрососудистая обструкция: тесная, но сложная взаимосвязь. Базовое разрешение Кардиол. 108:380.doi: 10.1007/s00395-013-0380-y

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Hu, L., Wang, J., Zhou, X., Xiong, Z., Zhao, J., Yu, R., et al. (2016). Экзосомы, полученные из жировых мензенхимальных стволовых клеток человека, ускоряют заживление кожных ран за счет оптимизации характеристик фибробластов. науч. Реп. 6:32993. дои: 10.1038/srep32993

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Константинидис, К., Уилан, Р.С. и Китсис Р. Н. (2012). Механизмы гибели клеток при сердечно-сосудистых заболеваниях. Артериосклероз. тромб. Васк. биол. 32, 1552–1562. doi: 10.1161/atvbaha.111.224915

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Котхапалли Д., Кастаньино П., Радер Д. Дж., Филлипс М. К., Лунд-Кац С. и Ассоян Р. К. (2013). Опосредованная аполипопротеином Е остановка клеточного цикла связана с р27 и зависимой от ЦОГ2 репрессией миР221/222. Атеросклероз 227, 65–71.doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2012.12.003

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Lai, R.C., Arslan, F., Lee, M.M., Sze, N.S., Choo, A., Chen, T.S., et al. (2010). Экзосомы, секретируемые МСК, уменьшают ишемию/реперфузию миокарда. Рез. стволовых клеток. 4, 214–222. doi: 10.1016/j.scr.2009.12.003

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Li, B., Lu, Y., Yu, L., Han, X., Wang, H., Mao, J., et al. (2017).МиР-221/222 способствует свойствам раковых стволовых клеток и росту опухоли рака молочной железы посредством нацеливания на PTEN и устойчивой активации Akt/NF-κB/COX-2. Хим. биол. Взаимодействовать. 277, 33–42. doi: 10.1016/j.cbi.2017.08.014

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Li, Y., Liu, Y., Tian, ​​X., Zhang, Y., Song, H., Liu, M., et al. (2017). Клеточный репрессор E1A-стимулируемых генов является критическим фактором ремоделирования сосудов в ответ на ангиотензин II. Артериосклероз. тромб. Васк. биол. 37, 485–494. doi: 10.1161/atvbaha.116.308794

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ли, К., Цуй, С., Цзин, Г., Дин, Х., Ся, З. и Хэ, X. (2019). Роль сигнального пути PI3K/Akt в защитном действии пропофола на повреждение кишечника и легких, вызванное ишемией/реперфузией кишечника1. Acta Цирк. Бюстгальтеры. 34:e201

000005. doi: 10.1590/s0102-8650201

000005

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ли, Ю., Chen, B., Yang, X., Zhang, C., Jiao, Y., Li, P., et al. (2019). Передача сигналов S100a8/a9 вызывает митохондриальную дисфункцию и гибель кардиомиоцитов в ответ на ишемическое/реперфузионное повреждение. Тираж 140, 751–764. doi: 10.1161/circulationaha.118.039262

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Liang, C.J., Shen, W.C., Chang, F.B., Wu, V.C., Wang, S.H., Young, G.H., et al. (2015). Эндотелиальные клетки-предшественники, полученные из вартонова желе пуповины человека, ослабляют острое ишемическое повреждение почек за счет усиления васкуляризации и уменьшения апоптоза, воспаления и фиброза. клеточный транспл. 24, 1363–1377. дои: 10.3727/0914×681720

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лян, С.Дж., Ван, С.Х., Чен, Ю.Х., Чанг, С.С., Хванг, Т.Л., Леу, Ю.Л., и соавт. (2011). Висколин снижает экспрессию VCAM-1 в эндотелиальных клетках, обработанных TNF-α, посредством пути JNK/NF-κB и ROS. Свободный радикал. биол. Мед. 51, 1337–1346. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2011.06.023

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лин, К.C., Yip, H.K., Shao, P.L., Wu, S.C., Chen, K.H., Chen, Y.T., et al. (2016). Комбинация мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ADMSC), и экзосом, полученных из ADMSC, для защиты почек от острого ишемически-реперфузионного повреждения. Междунар. Дж. Кардиол. 216, 173–185. doi: 10.1016/j.ijcard.2016.04.061

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Луо Р., Чен С., Ма Х., Яо С., Лю М., Тао Дж. и др. (2019). Активация миокардиальной каспазы-3 и NF-κB способствует индуцированному калпаином септическому апоптозу: роль пути Akt/eNOS/NO. Науки о жизни. 222, 195–202. doi: 10.1016/j.lfs.2019.02.048

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ma, L., Liu, H., Xie, Z., Yang, S., Xu, W., Hou, J., et al. (2014). Гинзенозид Rb3 защищает кардиомиоциты от ишемически-реперфузионного повреждения посредством ингибирования JNK-опосредованного пути NF-κB: модель кардиомиоцитов мыши. PLoS One 9:e103628. doi: 10.1371/journal.pone.0103628

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мандл, А., Хыонг Фам, Л., Тот, К., Замбетти, Г., и Эрхардт, П. (2011). Делеция Puma задерживает сердечную дисфункцию в моделях сердечной недостаточности у мышей за счет ослабления апоптоза. Тираж 124, 31–39. doi: 10.1161/circulationaha.110.988303

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Pu, C.M., Liu, C.W., Liang, C.J., Yen, Y.H., Chen, S.H., Jiang-Shieh, Y.F., et al. (2017). Стволовые клетки, полученные из жировой ткани, защищают кожные лоскуты от ишемии/реперфузии посредством экспрессии IL-6. Дж. Инвест. Дерматол. 137, 1353–1362. doi: 10.1016/j.jid.2016.12.030

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Samidurai, A., Roh, S.K., Prakash, M., Durrant, D., Salloum, F.N., Kukreja, R.C., et al. (2019). Сигнальная ось STAT3-miR-17/20 играет критическую роль в ослаблении инфаркта миокарда после лечения рапамицином у мышей с диабетом. Кардиовасц. Рез. 116, 2103–2115. doi: 10.1093/cvr/cvz315

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Сантос-Гальего, К.Г., Вал Т.П., Голиаш Г., Пикатост Б., Ариас Т., Исикава К. и др. (2016). Агонист сфингозин-1-фосфатных рецепторов финголимод увеличивает спасение миокарда и снижает неблагоприятное постинфарктное ремоделирование левого желудочка в модели ишемии/реперфузии у свиней. Тираж 133, 954–966. doi: 10.1161/circulationaha.115.012427

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Шен, В. К., Лян, К. Дж., Ву, В. К., Ван, С. Х., Янг, Г. Х., Lai, I.R., et al. (2013). Эндотелиальные клетки-предшественники, полученные из вартонова желе пуповины, уменьшают вызванное ишемией повреждение задних конечностей у мышей с диабетом, индуцируя экспрессию HIF-1α/IL-8. Разработка стволовых клеток. 22, 1408–1418. doi: 10.1089/scd.2012.0445

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Сонг Дж., Оуян Ю., Че Дж., Ли X., Чжао Ю., Ян К. и др. (2017). Потенциальная ценность миР-221/222 в качестве диагностических, прогностических и терапевтических биомаркеров заболеваний. Перед. Иммунол. 8:56. doi: 10.3389/fimmu.2017.00056

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Тан, Б., Ли, X., Рен, Ю., Ван, Дж., Сюй, Д., Ханг, Ю., и др. (2017). МикроРНК-29a регулирует индуцированные липополисахаридами (ЛПС) воспалительные реакции в мышиных макрофагах посредством пути Akt1/NF-κB. Экспл. Сотовый рез. 360, 74–80. doi: 10.1016/j.yexcr.2017.08.013

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Тан, Б., Ма Дж., Ха X., Чжан Ю. и Син Ю. (2018). Фактор некроза опухоли-альфа активировал PHLPP1 посредством активации ядерного фактора-каппа B во время ишемии/реперфузии миокарда. Науки о жизни. 207, 355–363. doi: 10.1016/j.lfs.2018.06.023

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Toth, A., Jeffers, J.R., Nickson, P., Min, J.Y., Morgan, J.P., Zambetti, G.P., et al. (2006). Целенаправленное удаление Puma ослабляет гибель кардиомиоцитов и улучшает сердечную функцию во время ишемии-реперфузии. утра. Дж. Физиол. Цирк Сердца. Физиол. 291, H52–H60. doi: 10.1152/ajpheart.01046.2005

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Валенсия-Санчес, Массачусетс, Лю, Дж., Хэннон, Г.Дж., и Паркер, Р. (2006). Контроль трансляции и деградации мРНК с помощью miRNAs и siRNAs. Гены Дев. 20, 515–524. doi: 10.1101/gad.1399806

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Вержанс Р., Питерс Т., Бомонт Ф.J., Van Leeuwen, R., Van Herwaarden, T., Verhesen, W., et al. (2018). Семейство микроРНК-221/222 противодействует фиброзу миокарда при сердечной недостаточности, вызванной перегрузкой давлением. Гипертония 71, 280–288. doi: 10.1161/hypertensionaha.117.10094

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Wang, S.H., Lin, S.J., Chen, Y.H., Lin, F.Y., Shih, J.C., Wu, C.C., et al. (2009). Эндотелиальные клетки с поздним отростком, полученные из вартонского желе в пуповине человека, уменьшают образование неоинтимы после повреждения сосудов: участие фактора, происходящего из пигментного эпителия. Артериосклероз. тромб. Васк. биол. 29, 816–822. doi: 10.1161/atvbaha.109.184739

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ван, X., Тао, Ю., Хуан, Ю., Чжан, К., Сюэ, М., Ван, Ю., и др. (2017). Каталаза уменьшает повреждение сердца, вызванное диабетом, за счет снижения p65/RelA-опосредованной транскрипции BECN1. J. Cell Mol. Мед. 21, 3420–3434. doi: 10.1111/jcmm.13252

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ван, З., Hao, W., Hu, J., Mi, X., Han, Y., Ren, S., et al. (2019). Мальтол улучшает гепатотоксичность, вызванную APAP, путем ингибирования окислительного стресса и воспалительной реакции через сигнальные пути NF-κB и PI3K/Akt. Антиоксиданты 8:395. doi: 10.3390/antiox80

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Xiao, J., Pan, Y., Li, X.H., Yang, X.Y., Feng, Y.L., Tan, H.H., et al. (2016). Экзосомы, полученные из клеток-предшественников сердца, предотвращают апоптоз кардиомиоцитов посредством экзосомальной миР-21 путем нацеливания на PDCD4. Дис. клеточной смерти. 7:e2277. doi: 10.1038/cddis.2016.181

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Xu, L., Fu, M., Chen, D., Han, W., Ostrowski, M.C., Grossfeld, P., et al. (2019). Эндотелиально-специфическая делеция Ets-1 ослабляет индуцированный ангиотензином II сердечный фиброз посредством подавления эндотелиально-мезенхимального перехода. BMB Rep. 52, 595–600. doi: 10.5483/BMBRep.2019.52.10.206

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ян, Б., Lin, H., Xiao, J., Lu, Y., Luo, X., Li, B., et al. (2007). Специфичная для мышц микроРНК miR-1 регулирует сердечный аритмогенный потенциал путем нацеливания на GJA1 и KCNJ2. Нац. Мед. 13, 486–491. doi: 10.1038/nm1569

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ян, X., Фу, Дж., Ван, Х., Лю, З., Ю, Л., Ю, Б. и др. (2019). Защитная роль и механизмы таурина в отношении апоптоза, вызванного гипоксией/реоксигенацией миокарда. Акта Кардиол. Грех. 35, 415–424.doi: 10.6515/acs.201907_35(4).20181218a

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Yang, Y., Li, C., Xiang, X., Dai, Z., Chang, J., Zhang, M., et al. (2014). Урсоловая кислота предотвращает стресс-опосредованный апоптоз эндоплазматического ретикулума, вызванный тепловым стрессом в сердечных миоцитах мыши. Дж. Мол. Сотовый Кардиол. 67, 103–111. doi: 10.1016/j.yjmcc.2013.12.018

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Юань, X., Ню, Х. Т., Ван, П. Л., Lu, J., Zhao, H., Liu, S.H., et al. (2015). Кардиопротекторный эффект ликохалкона D против ишемии/реперфузии миокарда в сердцах крыс, перфузированных по Лангендорфу. PLoS One 10:e0128375. doi: 10.1371/journal.pone.0128375

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Zhan, Y., Brown, C., Maynard, E., Anshelevich, A., Ni, W., Ho, I.C., et al. (2005). Ets-1 является критическим регулятором опосредованного Ang II воспаления и ремоделирования сосудов. Дж.клин. Вкладывать деньги. 115, 2508–2516. дои: 10.1172/jci24403

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжан С., Чжан Дж., Чжан А., Ван Ю., Хань Л., Ю Ю. и др. (2010). PUMA является новой мишенью миР-221/222 при раке эпителия человека. Междунар. Дж. Онкол. 37, 1621–1626. дои: 10.3892/ijo_00000816

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Чжан, Х., Сян, М., Мэн, Д., Сунь, Н., и Чен, С. (2016). Ингибирование ишемии/реперфузии миокарда экзосомами, секретируемыми мезенхимальными стволовыми клетками. Стволовые клетки Int. 2016:4328362. дои: 10.1155/2016/4328362

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжан В., Лю Х., Цзян Ю., Ван Н., Ли Ф. и Синь Х. (2019). 6-гингерол ослабляет индуцированный ишемией-реперфузией апоптоз клеток в кардиомиоцитах AC16 человека посредством пути HMGB2-JNK1/2-NK-κB. Эвид. Дополнение на основе. Альтернативный. Мед. 2019:8798653. дои: 10.1155/2019/8798653

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжан, X., Shao, S., Geng, H., Yu, Y., Wang, C., Liu, Z., et al. (2014). Профили экспрессии шести циркулирующих микроРНК, критически важных для атеросклероза, у пациентов с субклиническим гипотиреозом: клиническое исследование. Дж. Клин. Эндокринол. Метаб. 99, Е766–Е774. doi: 10.1210/jc.2013-1629

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжао, Л., Ян, X. Р., и Хань, X. (2019). МикроРНК-146b индуцирует сигнальный путь PI3K/Akt/NF-κB для уменьшения воспаления сосудов и апоптоза при инфаркте миокарда путем нацеливания на PTEN. Экспл. тер. Мед. 17, 1171–1181. doi: 10.3892/etm.2018.7087

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжао, К. Д., Вишванадхапалли, С., Уильямс, П., Ши, К., Тан, К., Йи, X., и др. (2015). НАДФН-оксидаза 4 вызывает сердечный фиброз и гипертрофию посредством активации сигнальных путей Akt/mTOR и NFκB. Тираж 131, 643–655. doi: 10.1161/circulationaha.114.011079

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжао Ю., Ransom, J.F., Li, A., Vedantham, V., Von Drehle, M., Muth, A.N., et al. (2007). Нарушение регуляции кардиогенеза, сердечной проводимости и клеточного цикла у мышей, лишенных микроРНК-1-2. Сотовый 129, 303–317. doi: 10.1016/j.cell.2007.03.030

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжоу, Ю., Чен, К., Лью, К.С., Ричардс, А.М., и Ван, П. (2016). Открытие потенциальных терапевтических мишеней миРНК при ишемически-реперфузионном повреждении сердца. Дж. Кардиовасц.Фармакол. тер. 21, 296–309. дои: 10.1177/1074248415604463

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Zhu, N., Zhang, D., Chen, S., Liu, X., Lin, L., Huang, X., et al. (2011). Обогащенные эндотелием микроРНК регулируют вызванное ангиотензином II воспаление и миграцию эндотелия. Атеросклероз 215, 286–293. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2010.12.024

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

номеров дней на 2021 год

Нажмите здесь, чтобы узнать дни в 2022 году

На этой странице перечислены все дни в 2021 году с номерами дней и недель.
В 2021 году 365 дней.

« Номера дней на 2020 год | номера дней на 2022 год »

92% 9.32% 9.86% 9.44% (SAT) (ср.) 90,68% 97.26% 93,70%
Дата Номер дня ber Дней основной Дней с сегодняшнего дня
(пятница, 25-е)
неделя NUM BER % %
1 января (FRI) день 1 364 -448 неделя 53, 2020146 неделя 53, 2020146 0,00%
январь 2, 2021 (Сб) День 2 363 -447 Неделя 53, 2020 0.27%
января 3, 2021 г. (Sun) день 3 день 3 362 -446 -446 неделя 53, 2020146 неделя 53, 2020 0,55%
4 января, 2021 г. (понедельник) день 4 361 -4445 неделя 1 неделя 1 0,82%
день 5 360 9 360 -444 9 неделя 1 1,10%
, 2021 (ср) День 6 359 -443 Неделя 1 1.37%
1 января 2021 г. (Thu) день 7 день 7 358 358 -4442 неделя 1 1,64%
80147 (FRI) день 8 357 -441 неделя 1 1 1,92%
день 9 день 9 356 -4440 неделя 1 2,19%
10 января 2021 г. (Вс) День 10 355 -439 Неделя 1 2.47%
1 января 11 января день 11 день 11 3 — 438 -438 неделя 2 2,74%
12 января 2021 г. (TUE) день 12 353 -437 -437 неделя 2 3 3.01%
13 января, 2021 г. (ср.) день 13 352 -436 неделя 2 3,29%
1 января 2021 г. (Чт) День 14 351 -435 Неделя 2 3.56%
15 января, 2021 г. (FRI) день 15 день 15 350 -434 -434 неделя 2 3,84%
16 января 2021 (SAT) день 16 349 -433 -433 неделя 2 недели 2 4.11%
1 января 2021 день (Sun) день 17 348 -432 неделя 2 4,38%
1 января 2021 г. (Пн) День 18 347 -431 Неделя 3 4.66%
19 января, 2021 г. (TUE) день 19 день 19 3 -430 -430 неделя 3 4,93%
20 января 2021 г. (ср.) день 20 345 -429 Неделя 3 Неделя 3 5,21%
21 января 21 января 9021 (Thu) день 21 394 -428 неделя 3 5.48%
22 января 2021 г. (Пт) День 22 343 -427 Неделя 3 5.75%
23 января, 2021 г. (SAT) день 23 день 23 3 -426 неделя 3 6.03%
24 января 2021 г. (Sun) день 24 341 -425 -425 Неделя 3 60146 60140 25 января, 2021 г. (пн) день 25 340 9 -424 неделя 4 6.58%
26 января 2021 г. (Вт) День 26 339 -423 Неделя 4 6.85%
27 января, 2021 г. (ср.) день 27 379 -422 9 -422 9 неделя 4 7.12%
28 января 2021 (Thu) день 28 337 -421 -421 неделя 4 70146 70140
29 января 2021 г. (FRI) день 29 399 -420 неделя 4 7,67%
30 января 3021 г. (Сб) День 30 335 -419 Неделя 4 7.95%
31 января
31 января 9021 г. (Солнце) день 31 314 -418 -418 неделя 4 8.22%
1 февраля, 2021 г. (Мон) день 32 32 3233 -417 -417 неделя 5 80146 80140
29 февраля день 33 332 -416 неделя 5 80140
3 февраля 2021 г. (Среда) День 34 331 -415 Неделя 5 9.04%
4 февраля, 2021 г. (Thu) день 35 330 330 -414 неделя 5 9,32%
5 февраля, 2021 г. (FRI) день 36 329 -413 -413 неделя 5 неделя 5 9.59%
60147
день 37 399 -412 неделя 5 9,86%
7 февраля (Вс) День 38 327 -411 Неделя 5 10.14%
80140
день 39 день 39 326 -410 неделя 6 10.41%
день (Tue) день 40 325 -409 неделя 6 неделя 6 10,68%
100147
10 февраля день 41 день 41 324 -408 неделя 6 10.96%
февраля 11 февраля (Чт) День 42 323 -407 Неделя 6 11.23%
12 февраля, 2021 г. (FRI) день 43 день 43 322 -406 неделя 6 11.51%
день 44 321 -405 неделя 6 неделе 6 11.78%
14 февраля 2021 г. (Sun) день 45 320 -404 неделя 6 12.05%
15 февраля 2021 г. (Пн) День 46 319 -403 Неделя 7 12.33%
16 февраля, 2021 г. (Вт) день 47 318 -402 -402 неделе 7 12.60%
17 февраля 2021 (ср.) день 48 317 -401 неделя 7 неделе 7 12,88%
день (Thu) день 49 316 -400 неделя 7 13.15%
19 февраля 19, 2021 гг. (Пт) День 50 315 -399 Неделя 7 13.42%
20 февраля 2021 года (SAT) день 51 день 51 314 -398 -398 неделя 7 13,70%
21 февраля 2021 г. (Sun) день 52 313 -397 -397 неделя 7 неделя 7 13.97%
22 февраля, 2021 г. (пн) день 53 312 -396 неделя 8 14,25%
23 февраля (Вт) День 54 311 -395 Неделя 8 14.52%
24 февраля 2021 (ср.) день 55 310 -394 -394 неделя 8 14,79%
25 февраля, 2021 г. (Thu) день 56 309 -393 неделя 8 неделе 8 15.07%
26 февраля, 2021 г. (FRI) день 57 день 57 308 -392 неделя 8 15,34%
27 февраля 2021 г. (Сб) День 58 307 -391 Неделя 8 15.62%
28 февраля, 2021 г. (Солнце) день 59 день 59 306 -390 -390 неделя 8 15.89%
1 марта, 2021 г. (Мон) день 60146 305 -389 неделя 9 неделя 9 16.16%
2 марта 2021 (Вт) день 61 304 -388 неделя 9 16.44%
3 марта 2021 (Среда) День 62 303 -387 Неделя 9 16.71%
4 марта
день 63 день 63 302 -386 -386 неделя 9 16,99%
день 64 301 -385 неделя 9 неделя 9 17,26%
60141
марта день 65 день 65 300 -384 неделя 9 17,53%
70 марта 2021 г. (Вс) День 66 299 -383 Неделя 9 17.81%
марта 8, 2021 г. (пн) день 67 день 67 298 -382 -382 неделя 10 18.08%
9, 2021 г. (Tue) день 68 297 -381 неделя 10 неделя 10 18,36%
10 марта, 2021 г. (ср.) день 69 день 69 296 -380 неделя 10 18,63%
г. 11 марта, 2021 г. (Чт) День 70 295 -379 Неделя 10 18.90%
12 марта, 2021 г. (FRI) день 71 день 71 294 -378 -378 неделя 10 19,18%
13 марта, 2021 (SAT) день 72 293 -377 -377 неделя 10 19,45%
14 марта 2021 г. (Sun) день 73 Day 73 292 -376 неделя 10 19,73%
15 марта 2021 г. (Пн) День 74 291 -375 Неделя 11 20.00%
16 марта, 2021 г. (вт) день 75 290 290 -374 -374 неделя 11 20,27%
17 марта 2021 (ср.) день 76 289 -373 неделя 11 неделя 11 20.55%
18 марта 2021 г. (Thu) день 77 288 -372 -372 неделя 11 20,82%
9, 2021 (пт) День 78 287 -371 Неделя 11 21.10%
20 марта 2021 г. (SAT) день 79 день 79 286 -370 неделя 11 неделя 11 21,37%
21 марта 21 марта 2010 г. (Sun) день 80 285 -369 неделя 11 неделя 11 21,64%
22 марта 2021 г. (пн) день 81 284 -368 неделя 12 21.92%
23 марта, 2021 г. (Вт) День 82 283 -367 Неделя 12 22.19%
24 марта 2021 г. (ср.) день 83 день 83 282 -366 -366 неделя 12 22,47%
25 марта 2021 (Thu) день 84 281 -365 неделя 12 неделя 12 22.74%
26 марта 2021 г. (FRI) день 85 280 -364 неделя 12 23.01%
27 марта 2021 (Сб) День 86 279 -363 Неделя 12 23.29%
28 марта, 2021 г. (Sun) день 87 день 87 278 -362 -362 неделя 12 23.56%
29 марта, 2021 г. (МОН) день 88 277 -361 неделя 13 неделя 13 23,84%
30 марта, 2021 г. (вт) день 89 276 -360 неделя 13 24.11%
31 марта 2021 г. (Среда) День 90 275 -359 Неделя 13 24.38%
1 апреля
апреля день 91 день 91 274 -358 -358 неделя 13 24,66%
2 апреля 2021 (FRI) день 92 273 -357 неделя 13 неделя 13 24,93%
день 93 272 93 272 -356 Неделя 13 25,21%
4 апреля 2021 г. (Вс) День 94 271 -355 Неделя 13 25.48%
апреля 50140 апреля день 95 день 95 270 — 354 -354 неделя 14 25.75%
6 апреля 2021 г. (TUE) день 96 269 -353 -353 неделя 14 неделе 14 26.03%
70141 день 97 день 97 268 -352 неделя 14 26.30%
8 апреля 2021 г. (Чт) День 98 267 -351 Неделя 14 26.58%
9 апреля
9 апреля день 99 день 99 266 -350 -350 неделя 14 26,85%
10 апреля 2021 (SAT) день 100 265 -349 -349 неделя 14 27.12%
апреля день 101 день 101 264 -348 неделя 14 27,40%
12 апреля 2021 г. (Пн) День 102 263 -347 Неделя 15 27.67%
13 апреля, 2021 г. (вт) день 103 день 103 262 — 346 -346 неделя 15 27.95%
14 апреля 2021 (ср.) день 104 261 -345 -345 неделя 15 неделя 15 28,22%
15 апреля 2021 г. (Thu) день 105 260 -344 неделя 15 28,49%
16 апреля 2021 г. (пт) День 106 259 -343 Неделя 15 28.77%
17 апреля 2021 г. (SAT) день 107 день 107 258 -342 -342 неделя 15 29.04%
18 апреля 2021 (Солнце) день 108 257 -341 -341 Неделя 15 Неделя 15 29,32%
день 109 день 109 256 -340 Неделя 16 29,59%
20 апреля 2021 г. (Вт) День 110 255 -339 Неделя 16 29.86%
21 апреля, 2021 г. (ср.) день 111 день 111 254 -334 -3338 неделя 16 30.14%
22 апреля 2021 (Thu) день 112 253 -337 неделя 16 неделя 16 30.41%
23 апреля 2021 г. (FRI) день 113 252 -336 неделя 16 30,68%
24 апреля 2021 г. (Сб) День 114 251 -335 Неделя 16 30.96%
25 апреля, 2021 г. (Солнце) день 115 день 115 250 -334 -334 9 неделя 16 31,23%
26 апреля 2021 (Mon) день 116 249 -333 неделя 17 неделя 17 31.51%
день 117 день 117 248 -332 неделя 17 31,78%
28 апреля, 2021 г. (Среда) День 118 247 -331 Неделя 17 32.05%
29 апреля 2021 г. (Thu) день 119 день 119 246 -330 неделя 17 неделя 17 32,33%
30 апреля 2021 (FRI) день 120 245 -329 Неделя 17 неделя 17 32.60%
день 121 день 121 244 -328 неделя 17 32,88%
2 мая 2, 2021 (Вс) День 122 243 -327 Неделя 17 33.15%
3 мая 2021 г. (пн) день 123 день 123 242 9 -326 неделя 18 33.42%
4 мая 2021 г. (TUE) день 124 241 -325 -325 неделя 18 неделя 18 33.70%
5 мая 2021 г. (ср.) день 125 240 -324 неделя 18 33,97%
6 мая 2021 (Чт) День 126 239 -323 Неделя 18 34.25%
мая 7, 2021 г. (пт) день 127 день 127 238 -322 неделя 18 3452%
мая 8, 2021 (SAT) день 128 237 -321 -321 неделя 18 неделя 18 34.79%
9 мая 2021 г. (Солнце) день 129 236 -320 Неделя 18 35.07%
10 мая 2021 (Пн) День 130 235 -319 Неделя 19 35.34%
11 мая 2021 г. (TUE) день 131 день 131 234 -318 -318 неделя 19 35.62%
12 мая 2021 (ср) день 132 233 -317 -317 Неделя 19 35,89%
13 мая 2021 г. (Thu) день 133 232 -316 неделя 19 36,16%
мая 14, 2021 (Пт) День 134 231 -315 Неделя 19 36.44%
15 мая 2021 (SAT) день 135 день 135 230 -314 неделя 19 неделя 19 36,71%
9 мая 2021 г. (Sun) день 136 229 -3146 -313 неделя 19 36.99%
9 мая 2021 г. (пн) день 137 228 — 312 неделя 20 37,26%
Магию 18, 2021 г. (Вт) День 138 227 -311 Неделя 20 37.53%
мая 19, 2021 (ср) день 139 день 139 226 -310 неделя 20 37.81%
мая 20, 2021 г. (Thu) день 140 225 -309 Неделя 20 неделя 20 38.08%
21 мая 2021 (FRI) день 141 224 -308 неделя 20 38,36%
22 мая 2021 (Сб) День 142 223 -307 Неделя 20 38.63%
23 мая 2021 (Солнце) день 143 222 — 306 -306 неделя 20 38,90%
магии 24, 2021 (понция) день 144 221 -305 неделя 21 неделя 21 39,18%
25 мая 2021 г. (TUE) день 145 220 -304 неделя 21 39,45%
мая 26, 2021 гг. (Среда) День 146 219 -303 Неделя 21 39.73%
27 мая, 2021 (Thu) день 147 день 147 218 -302 -302 неделя 21 40,00%
28 мая 2021 г. (FRI) день 148 217 -301 неделя 21 неделя 21 40,27%
мая день 149 день 149 216 -300 неделя 21 40,55%
30 мая 3021 (Вс) День 150 215 -299 Неделя 21 40.82%
31 мая, 2021 г. (пн) день 151 день 151 214 -298 -298 неделя 22 41.10%
1 июня 2021 г. (TUE) день 152 213 -297 неделя 22 неделя 22 41.37%
2 июня 2021 г. (ср.) день 153 212 -296 неделя 22 41,64%
3 июня 2021 г. (Чт) День 154 211 -295 Неделя 22 41.92%
4 июня, 2021 г. (FRI) день 155 день 155 210 -294 9 -294 9 неделя 22 42.19%
5 июня 2021 (SAT) день 156 209 -293 неделя 22 неделя 22 42,47%
60141 день (Sun) день 157 день 157 208 -292 неделя 22 42,74%
7 июня 2021 г. (Пн) День 158 207 -291 Неделя 23 43.01%
80146 день 159 день 159 206 -290 -290 неделя 23 43.29%
9, 2021 г. (ср.) день 160 205 -289 неделя 23 неделя 23 43.56%
день 161 день 161 204 -288 неделя 23 43,84%
11 июня, 2021 г. (Пт) День 162 203 -287 Неделя 23 44.11%
12 июня, 2021 г. (SAT) день 163 день 163 202 -286 -2-286 неделя 23 44.38%
13 июня, 2021 г. (Sun) день 164 -285 неделя 23 неделя 23 44,66%
14 июня, 2021 г. (пн) день 165 200 -284 Неделя 24 44,93%
15 июня 2021 г. (Вт) День 166 199 -283 Неделя 24 45.21%
16 июня 2021 г. (ср.) день 167 день 167 — 28 -282 неделя 24 45,48%
17 июня, 2021 г. (Thu) день 168 197 -281 -281 неделя 24 45.75%
18 июня, 2021 г. (FRI) день 169 день 169 99 196 -280 неделя 24 46.03%
июнь 19, 2021 г. (Сб) День 170 195 -279 Неделя 24 46.30%
20 июня 2021 г. (Sun) день 171 день 171 194 9 9 9 -278 неделя 24 46,58%
21 июня, 2021 г. (Пн) день 172 день 173 -277 -277 Неделя 25 60146 46.85%
22 июня 2021 г. (Вт) День 173 192 -276 Неделя 25 47,12%
23 июня, 2021 г. (Среда) День 174 191 -275 Неделя 25 47.40%
24 июня, 2021 г. (Thu) день 175 день 175 190 -274 -274 неделя 25 47.67%
25 июня, 2021 г. (FRI) день 176 -273 неделя 25 неделя 25 47.95%
26 июня, 2021 г. (SAT) день 177 день 177 188 -2-272 неделя 25 48,22%
27 июня 2021 г. (Вс) День 178 187 -271 Неделя 25 48.49%
28 июня
день 179 день 179 186 -270 неделя 26 неделя 26 48,77%
29 июня 2021 г. (TUE) день 180 185 -269 неделя 26 неделя 26 49.04%
день 181 день 181 184 -268 неделя 26 49,32%
1 июля 1, 2021 гг. (Чт) День 182 183 -267 Неделя 26 49.59%
2 июля
2 июля день (FRI) день 183 день 183 -266 -266 неделя 26 49,86%
3 июля 2021 (SAT) день 184 181 -265 неделя 26 неделя 26 50.14%
4 июля 2021 г. (Солнце) день 185 180 -264 неделя 26 50,41%
июль 5, 2021 г. (Пн) День 186 179 -263 Неделя 27 50.68%
6 июля, 2021 г. (вт) день 187 день 187 178 -262 неделя 27 50,96%
70147
день 188 день 187 -261 неделя 27 неделя 27 51.23%
8, 2021 г. (Thu) день 189 день 189 176 -260 неделя 27 51.51%
9 июля 9, 2021 гг. (Пт) День 190 175 -259 Неделя 27 51.78%
10 июля, 2021 г. (SAT) день 191 день 191 174 -258 -258 неделя 27 52.05%
11 июля 2021 г. (Солнце) день 192 173 -257 -257 неделя 27 неделя 27 52,33%
12 июля 2021 г. (пн) день 193 172 -2156 неделя 28 52,60%
13 июля, 2021 г. (Вт) День 194 171 -255 Неделя 28 52.88%
14 июля, 2021 г. (ср.) день 195 день 195 170 -254 неделя 28 53.15%
15 июля 2021 (Thu) день 196 99 169 99 -253 -253 неделя 28 неделя 28 53.42%
16 июля 2021 г. (FRI) день 197 день 197 -252 неделя 28 53,70%
г. 17 июля 2021 г. (Сб) День 198 167 -251 Неделя 28 53.97%
18 июля, 2021 г. (Sun) день 199146 день 199 166 -250 -250 неделя 28 54.25%
(Mon) день 200 165 -249 -2149 неделя 29 неделя 29 54.52%
20 июля 2021 (Вт) день 2010146 164 -248 неделя 29 54,79%
21 июля 2021 (Среда) День 202 163 -247 Неделя 29 55.07%
22 июля, 2021 г. (Thu) день 203 день 203 162 -246 неделя 29 55,34%
23 июля 2321 (FRI) день 204 161 -245 -245 Неделя 29 55.62%
День 205 День 205 160 -244 Неделя 29 55,89%
25 июля 2021 г. (Вс) День 206 159 -243 Неделя 29 56.16%
26 июля 20210 26 июля 2021 г. (пн) день 207 день 207 158 -242 неделя 30 56,44%
27 июля, 2021 г. (Tue) день 208 -241 -241 неделя 30 56,7146 56.71%
28 июля 2021 (Ср) день 209 156 -240 неделя 30 56.99%
29 июля 2921 (Чт) День 210 155 -239 Неделя 30 57.26%
30, 202140 30 июля, 2021 г. (FRI) день 211 день 211 154 -238 неделя 30 неделя 30 57.53%
31 июля, 2021 (SAT) день 212 153 -237 -237 неделя 30 57,8146 57,81%
1 августа 2021 г. (Sun) день 213 день 213 152 -236 Неделя 30 58,08%
августа 2, 2021 (Пн) День 214 151 -235 Неделя 31 58.36%
августа 3, 2021 г. (TUE) день 215 день 215 150 -234 — 234 неделя 31 58,63%
4 августа 2021 (ср.) день 216 149 -233 -233 неделя 31 58.90%
день 217 день 217 148 -232 неделя 31 59,18%
6 августа 2021 г. (Пт) День 218 147 -231 Неделя 31 59.45%
70140 августа 7, 2021 г. (SAT) день 219 день 219 146 -230 неделя 31 неделя 31 59.73%
августа 8, 2021 (Sun) день 220 145 -229 неделя 31 неделя 31 60140
августа день 221 день 221 144 -228 неделя 32 60,27%
августа 10 августа 2021 года (Вт) День 222 143 -227 Неделя 32 60.55%
11 августа, 2021 г. (ср.) день 223 день 223 142 -226 неделя 32 60,82% 60,82%
12 августа 2021 (Thu) день 224 141 -225 неделя 32 неделя 32 61.10%
13 августа 2021 (пт) день 225 140 -224 неделя 32 61.37%
14 августа 2021 г. (Сб) День 226 139 -223 Неделя 32 61.64%
15 августа, 2021 г. (Sun) день 227 138 138 -2222 9 неделя 32 61.92%
День 228 137 -221 -221 неделя 33 62.19%
17 августа 2021 г. (вт) день 229 136 -220 неделя 33 62,47%
18 августа, 2021 г. (Среда) День 230 135 -219 Неделя 33 62.74%
августа 19, 2021 г. (thu) день 231 день 231 134 -218 -2118 неделя 33 63.01%
августа 20, 2021 (FRI) день 232 133 -217 неделя 30146 неделя 33 63.29%
21 августа, 2021 г. (SAT) день 233 день 233 132 -2116 неделя 33 63.56%
22 августа 2021 (Вс) День 234 131 -215 Неделя 33 63.84%
23 августа, 20210 день 235 день 235 130 -214 -21414 неделя 34 64.11%
24 августа 2021 г. (Tue) день 236 129 -213 -213 неделя 34 64.38%
25 августа 2021 (ср.) день 237 128 -212 неделя 34 64,66%
26 августа 2021 года (Чт) День 238 127 -211 Неделя 34 64.93%
27 августа, 2021 г. (FRI) день 239 день 239 126 -210 неделя 34 65,21%
28 августа 2021 (SAT) день 240 125 -209 неделя 34 неделя 34 65,48%
29 августа 2021 г. (Sun) день 241 день 241 124 -208 неделя 34 65,75%
30 августа 3021 г. (Пн) День 242 123 -207 Неделя 35 66.03%
31 августа
августа 31 августа, 2021 г. (вт) день 243 122 -206 -206 9 неделя 35 66.30%
день 244 121 -205 неделя 39 неделя 35 66.58%
день (Thu) день 245 120 -204 неделя 35 66,85%
3 сентября 2021 г. (Пт) День 246 119 -203 Неделя 35 67.12%
день (SAT) день 247 день 247 118 -202 неделя 35 67.40% 67.40%
5 сентября 2021 г. (Солнце) день 248 117 -201 неделя 35 неделя 35 67.67%
60147
день 249 день 249 116 -200 неделя 36 67.95%
7 сентября 2021 г. (Вт) День 250 115 -199 Неделя 36 68.22%
день 251 день 251 114 -198 -198 неделя 36 68.49%
(Thu) день 252 113 -197 -197 неделя 36 68.77%
день 253 день 253 112 -196 неделя 36 69,04%
11 сентября 2021 г. (Сб) День 254 111 -195 Неделя 36 69.32%
120140 (Sun) день 255 день 255 110 -194 -194 неделя 36 69.59%
(Mon) день 256 109 -193 -193 неделя 37 69,86%
14 сентября 2021 г. (TUE) день 257 108 -192 неделя 37 70,14%
15 сентября 2021 г. (Среда) День 258 107 -191 Неделя 37 70.41%
160140 16 сентября 2021 (Thu) день 259 день 259 -190 -190 неделя 37 70,68%
день 260 105 -189 -189 Неделя 37 7096%
день 261 день 261 104 -188 неделя 37 71,23%
(Вс) День 262 103 -187 Неделя 37 71.51%
20 сентября 2021 г. (пн) день 263 день 263 102 -186 неделя 38 71,78%
21 сентября 2021 г. (TUE) день 264 101 -185 неделя 38 72.0546 72.05%
день 265 день 265 100 -184 неделя 38 72,33%
23 сентября 2021 г. (Чт) День 266 99 -183 Неделя 38 72.60%
24 сентября, 2021 г. (FRI) день 267 98 98 -182 неделя 38 72,88% 72,88%
25 сентября 2021 (SAT) день 268 97 -181 -181 неделя 38 73.15%
26 сентября 2021 г. (Sun) день 269 день 269 96 -180 неделя 38 73,42%
27 сентября 2021 г. (Пн) День 270 95 -179 Неделя 39 73.70%
день 271 день 271 94 -178 -178 неделя 39 73,97%
29 сентября 2021 г. (ср.) День 272 93 -177 -177 неделя 39 74.25%
день 273 день 273 92 -176 неделя 39 74,52%
1 октября (Пт) День 274 91 -175 Неделя 39 74.79%
2 октября, 2021 г. (SAT) день 275 день 275 90 -174 -174 неделя 39 75.07% 75,07%
9 октября 2021 г. (Солнце) день 276 89 -173 неделя 39 75,34%
день 277 день 277 88 -172 неделе 40 75.62%
5 октября 2021 г. (Вт) День 278 87 -171 Неделя 40 75.89%
6 октября, 2021 г. (ср.) день 279 день 279 86 -170 неделя 40 76,16%
9, 2021 (Thu) день 280 85 -169 неделя 40 неделя 40 76.44%
9, 2021 г. (FRI) день 281 день 281 84 -168 неделя 40 76,71%
9 октября 2021 г. (Сб) День 282 83 -167 Неделя 40 76.99%
10 октября, 2021 г. (Sun) день 283 день 283 82 -166 неделя 40 77.26%
11 октября, 2021 г. (Mon) день 284 81 -165 неделя 41 77.53%
12 октября 2021 г. (Вт) день 285 80146 -164 неделя 41 неделя 41 77,81%
13 октября 2021 г. (Среда) День 286 79 -163 Неделя 41 78.08%
14 октября, 2021 г. (Thu) день 287 день 287 78 -162 неделя 41 неделя 41 78,36%
15 октября 2021 (FRI) день 288 77 -161 неделя 41 78.63%
16 октября 2021 (SAT) день 289 день 289 76 -160 неделя 41 78,90%
17 октября 2021 г. (Вс) День 290 75 -159 Неделя 41 79.18%
18 октября, 2021 г. (Mon) день 291 день 291 74 -158 неделя 42 неделя 42 7945%
(TUE) день 292 73 -157 неделя 42 79.73%
20 октября 2021 г. (ср.) день 293 день 293 72 -156 неделя 42 80,00%
21 октября 2021 г. (Чт) День 294 71 -155 Неделя 42 80.27%
22 октября, 2021 г. (пт) день 295 день 295 70 -154 -154 неделя 42 80,55%
23 октября, 2021 (SAT) день 296 69 -153 неделя 42 80,82%
24 октября 2021 г. (Sun) день 297 день 297 68 -152 неделя 42 81.10%
25 октября 2021 г. (Пн) День 298 67 -151 Неделя 43 81.37%
26 октября, 2021 г. (TUE) день 299 день 299 -150 -150 неделя 43 81,64%
27 октября, 2021 (ср.) день 300 65 -149 -149 неделя 43 81.92%
28 октября 2021 (Thu) день 301 день 301 64 -148 неделя 43 82.19%
29 октября 2021 г. (Пт) День 302 63 -147 Неделя 43 82.47%
30 октября, 2021 г. (SAT) день 303 день 303 62 -146 неделя 43 82,74% 82,74%
31 октября, 2021 г. (Sun) день 304 61 -145 -145 неделя 43 83.0146 83.01%
1 ноября 2021 г. (пн) день 305 60146 -144 неделя 44 83,29% 83,29%
Ноябрь 2, 2021 г. (Вт) День 306 59 -143 Неделя 44 83.56%
Ноябрь 3, 2021 г. (ср.) день 307 день 307 58 -142 неделя 44 83,84%
4 ноября 2021 (Thu) день 308 57 -141 -141 неделя 44 84.11%
день 309 день 309 56 -140 неделя 44 84,38%
6 ноября 2021 г. (Сб) День 310 55 -139 Неделя 44 84.66%
17 ноября 2021 г. (Солнце) день 311 день 311 -138 -138 неделя 44 84,93%
80147
день 312 53 -137 неделя 45 неделя 45 85.21%
день 313 день 313 52 -136 неделя 45 85,48%
10 ноября 2021 г. (Среда) День 314 51 -135 Неделя 45 85.75%
11 ноября, 2021 г. (Thu) день 315 день 315 50 -134 -134 9 неделя 45 86,03%
12 ноября 2021 (FRI) день 316 49 -133 недели 45 86.30%
день 317 день 317 48 -132 неделя 45 86,58%
14 ноября 2021 г. (Вс) День 318 47 -131 Неделя 45 86.85%
15 ноября 2021 г. (Mon) день 319 день 319 -130 -130 неделя 46 87.12%
16 ноября 2021 г. (TUE) день 320 45 -129 недели 46 87.40%
17 ноября 2021 г. (ср.) день 321 день 321 44 -128 неделя 46 87,67%
ноября 18, 2021 гг. (Чт) День 322 43 -127 Неделя 46 87.95%
19 ноября, 2021 г. (пт) день 323 день 323 —126 -126 неделе 46 88,22%
20 ноября 2021 (SAT) день 324 41 -125 неделя 46 неделя 46 88.49%
21 ноября 2021 г. (Sun) день 325 день 325 40 -124 неделя 46 88,77%
22 ноября, 2021 г. (Пн) День 326 39 -123 Неделя 47 89.04%
23.10140 23 ноября, 2021 г. (TUE) день 327 день 327 -122 -122 неделя 47 89,32%
24 ноября 2021 г. (ср.) день 328 37 37 -121 неделя 47 89,59%
25 ноября, 2021 г. (Thu) день 329 36 -120 неделя 47 89,86%
26 ноября 26, 2021 (Пт) День 330 35 -119 Неделя 47 90.14%
27 ноября, 2021 г. (SAT) день 331 день 331 331 -118 неделя 47 9041%
28 ноября, 2021 г. (Солнце) день 332 33 -117 неделя 47 90,68%
29 ноября, 2021 г. (Mon) день 333 день 333 32 -116 неделя 48 9096%
30 ноября 3021 г. (Вт) День 334 31 -115 Неделя 48 91.23%
1 декабря, 2021 г. (ср.) день 335 день 335 30 -114 неделя 48 91,5140146 91,5140
2 декабря 2021 (Thu) день 336 29 -113 Неделя 49 неделя 48 91,78%
день (FRI) день 337 день 337 28 -112 неделя 48 92,05%
4 декабря 2021 (Сб) День 338 27 -111 Неделя 48 92.33%
5 декабря 2021 г. (Sun) день 339 день 339 26 -110 неделя 48 92,60% 92.60%
6 декабря 2021 (Mon) день 340146 25 -109 неделя 49 92,88%
день 341 день 341 24 -108 неделя 49 93,15%
(Среда) День 342 23 -107 Неделя 49 93.42%
9 декабря 2021 (Thu) день 343 день 343 22 -106 неделя 49 93,70%
10 декабря 2021 (FRI) день 344 21 -105 неделя 49 93.97%
день 345 день 345 20 -104 неделя 49 94,25%
12 декабря 2021 (Вс) День 346 19 -103 Неделя 49 94.52%
13 декабря 2021 г. (Mon) день 347 день 347 18 -102 неделя 50 неделя 50 94,79%
14 декабря 2021 г. (TUE) день 348 -101 неделя 50 неделя 50 95.07%
15 декабря 2021 (ср.) день 349 16 -100 неделя 50 95,34%
16 декабря 2021 (Чт) День 350 15 -99 Неделя 50 95.62%
17 декабря 2021 г. (FRI) день 351 день 351 14 -98 неделю 50 неделя 50 95,89%
18 декабря 2021 (SAT) день 352 13 -97 неделя 50 неделя 50 96,16%
декабря день 353 день 353 12 -96 неделя 50 96,44%
20 декабря 2021 (Пн) День 354 11 -95 Неделя 51 96.71%
21 декабря 21 декабря, 2021 г. (вт) день 355 день 355 10 -94 неделя 51 96,9 96,99%
22 декабря 2021 (ср.) День 356 9 -93 неделя 51 97.26%
23 декабря 2021 г. (Thu) день 357 Day 357 8 -92 9 неделя 51 97.53%
24 декабря 2021 (пт) День 358 7 -91 Неделя 51 97.81%
25 декабря, 2021 г. (SAT) день 359 день 359 6 -90 неделя 51 неделя 51 98.08%
26 декабря 2021 (Sun) день 360146 5 -89 неделя 51 98,36%
27 декабря 2021 г. (пн) день 361 день 361 4 -88 неделя 52 98,63%
28 декабря, 2021 г. (Вт) День 362 3 -87 Неделя 52 98.90%
29 декабря 2021 (ср.) день 363 день 363 2 -86 неделя 52 99,18% 99,18%
30 декабря 2021 (Thu) день 364 1 -85 неделя 52 99 4 99.45%
31 декабря 2021 г. (FRI) день 365 день 365 0 -84 неделя 52 99,73%

« Номера дней на 2020 год | номера дней на 2022 год »

Другие годы: 1920-1989 | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 | 2012 | 2013 | 2014 | 2015 | 2016 | 2017 | 2018 | 2019 | 2020 | 2021 | 2022 | 2023 | 2024 | 2025 | 2026 | 2027 | 2028 | 2029 | 2030 | 2031 | 2032 | 2033 | 2034 | 2035 | 2036 | 2037 | 2038 | 2039 | 2040

См. также : Номера недель на 2021 год

OL-220, OL-221, OL-222, OL-223, OL-224, OL-225 или OL-226 при использовании онлайн-служб

Обзор

Чтобы сделать возможной загрузку транзакций в Quicken, финансовые учреждения создают файлы Quicken в специальном формате.Иногда эти файлы изменяются таким образом, что их нельзя загрузить в Quicken.

Прежде чем начать

  • При получении этих ошибок мы рекомендуем сначала проверить Сообщество Quicken на наличие предупреждений о широко распространенных проблемах или сбоях в работе банка.
  • Возможно, вы сможете успешно войти на веб-сайт своего банка, но по-прежнему будете получать сообщение об ошибке в Quicken из-за проблемы с файлом, отправляемым банком.
  • VPN может вызвать появление этой ошибки при использовании Quicken.Отключение VPN обычно решает проблему.
  • Вы можете выполнить следующие шаги, чтобы попытаться обновить соединение; это гарантирует, что вы сможете получить последний файл от вашего финансового учреждения. Однако в конечном итоге это может потребоваться решить вашему банку.
  • Если вы получаете одну из этих ошибок при попытке добавить учетную запись в Quicken в первый раз, это может означать, что банк требует от вас авторизации для предоставления доступа к Quicken. Попробуйте войти на веб-сайт банка и найти подсказки для подтверждения.Для авторизации доступа может потребоваться обращение в банк.

Найдите финансовое учреждение, вызвавшее ошибку

  1. Откройте Tools > One Step Update Summary , чтобы найти банк, в котором представлена ​​эта ошибка OL. Кроме того, проверьте точный код ошибки, который вы получаете, чтобы подтвердить, что это одна из описанных здесь ошибок.
  2. Откройте реестр для этого банковского счета.
  3. Щелкните Действия с учетной записью (кнопка или значок шестеренки) в правом верхнем углу реестра.

  1. Выберите Обновить сейчас.

Подождите и повторите попытку позже

. Если после завершения процесса «Обновить сейчас» проблема не устранена, попробуйте обновить свои аккаунты на следующий рабочий день. Эта ошибка может быть вызвана временным отключением или техническим обслуживанием сервера финансового учреждения, которое может быть устранено на следующий день.

Если проблема не устранена

Если после ожидания проблема не будет решена, вам потребуется определить тип подключения затронутых аккаунтов, чтобы определить, какие дальнейшие действия необходимо предпринять.Для этого перейдите в Инструменты > Список учетных записей , найдите затронутые учетные записи и подтвердите тип подключения в скобках в столбце Загрузить транзакцию .

  • Direct Connect . Для решения этой проблемы вам необходимо связаться с вашим финансовым учреждением. У Quicken нет доступа к серверам финансового учреждения, чтобы решить проблему. Для этого вам может потребоваться обратиться к специалисту по онлайн-услугам, который решает проблемы с загрузкой транзакций в финансовом учреждении.  Если ваше финансовое учреждение заявляет, что не может помочь, может потребоваться эскалация в финансовом учреждении.  
  • Express Web Connect . Обратитесь за помощью в службу поддержки Quicken.

alexxlab

E-mail : alexxlab@gmail.com

Submit A Comment

Must be fill required * marked fields.

:*
:*