3.5. Роль миР-221/222 в эндометриальной карциноме

Эндометриальная карцинома (ЭК) является четвертой по распространенности злокачественной опухолью у женщин в развитых странах и наиболее частым раком женских половых путей; однако заболеваемость карциномой эндометрия перемещается в молодое население из-за факторов ожирения и образа жизни в Китае [122].Эстроген является классическим этиологическим фактором онкогенеза эндометрия [123]. При карциноме эндометрия нарушение регуляции ER α , вызванное геномными или эпигенетическими аберрациями, было преобладающим явлением, которое снижало экспрессию ER α и ассоциировалось с обширной инвазией, высокой стадией и плохим прогнозом [124, 125].

Лю и др. обнаружили, что экспрессия миР-222-3p была намного ниже в ER α -положительных, чем в ER α -негативных образцах ткани карциномы эндометрия, а уровень экспрессии миР-222-3p был ниже в опухолях более низкой степени и более ранней стадии. .Репортерные анализы TargetScould и люциферазы показали, что ER α был мишенью miR-222-3p. Следовательно, миР-222-3p была сверхэкспрессирована в ER α -негативных опухолях эндометриальной карциномы и была связана с метастазами высокой степени злокачественности, поздней стадии и узловыми метастазами, а высокий уровень миР-222-3p был механизмом резистентности эндометрия к ралоксифену. терапия карциномы. Более того, с помощью анализа qRT-PCR miRNA у 46 пациентов с EC и 28 женщин без рака в анамнезе было обнаружено значительное увеличение уровней миР-222 в сыворотке пациентов с карциномой эндометрия.В будущем он может быть использован в качестве подходящего маркера для диагностики карциномы эндометрия [126].

4. Заключение

Как резюмировано выше, микроРНК-221/222 (миР-221/222) представляет собой некодирующую микроРНК, широко распространенную в эукариотических организмах и активно участвующую в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов. Важно, что уровень экспрессии miR-221/222 тесно связан со стадией опухоли и прогнозом. Он может быть использован в качестве биомаркера для диагностики предраковых опухолей [104] и стать новой мишенью для терапии опухолей [8–33, 35, 38, 51, 94], в качестве терапевтического средства при лекарственной устойчивости или чувствительности к противоопухолевым препаратам. [127].

Однако необходимо ответить и на другие вопросы, которые должны быть переведены в клинические стратегии. Во-первых, учитывая сложные сети, в которых расположены раковые клетки, роль miR-221/222 в различных клеточных фонах, а также ее гены-мишени нуждаются в дополнительных разъяснениях микросетей. Например, лаборатория объявила, что миР-222 способствует пролиферации клеточной линии немелкоклеточного рака легкого человека h560 [128]; напротив, почти в то же время Yamashita и коллеги [129] продемонстрировали, что miR-221/222 способствует росту клеточных линий h560, в то время как miR-221 ингибирует рост других четырех клеточных линий NSCLC.Другим примером является то, что низкая экспрессия миР-221/222 ингибирует злокачественную пролиферацию клеток гладких мышц сосудов [130], но также ингибирует рост клеток миокарда и увеличение маркеров пролиферации мышечных клеток, вызванное физической нагрузкой [131]. Стоит отметить, что модельные микроРНК, проанализированные и трансфицированные в образцах опухолей, могут обладать изомиР-свойствами, что может привести к противоречивости некоторых результатов.

Во-вторых, по мере углубления исследований уровень экспрессии миР-221 и миР-222 не пропорционален развитию опухоли, в то время как их функции многочисленны.Поэтому ожидается, что соотношение уровня экспрессии miR-221 и miR-222 станет новой областью исследований [66].

Наконец, ожидается, что одна микроРНК может действовать как терапевтический ингибитор клеточного пути рака, регулируя различные гены, участвующие в сети. Например, miR-221/222 может ингибировать экспрессию факторов транскрипции ER- α и FOXO3A, что приводит к общему изменению экспрессии генов за счет ингибирования экспрессии ER- α и FOXO3A на посттранскрипционной стадии.Супрессированный ER- α обладает способностью негативно регулировать miR-221/222, а супрессированный FOXO3A блокирует транскрипционную активацию p27 и Bim [63]. Это показывает, что регуляция отдельных микроРНК может иметь большой терапевтический потенциал в отношении различных видов рака. Возвращаясь к клинической стратегии, было продемонстрировано, что для эффективного подавления онкомиРНК олигонуклеотиды на основе заблокированных нуклеиновых кислот (LNA-) обладают большим потенциалом в качестве ингибиторов малых РНК-мишеней [132].

Доступность данных

Некоторые или все данные, модели или код, сгенерированные или использованные в ходе исследования, можно получить у соответствующего автора по запросу.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2018YFC0310900), Открытым исследовательским фондом Государственной ключевой лаборатории химии биоорганических и натуральных продуктов (SIOC, CAS) и Выдающимся университетом Фудань. План талантов (Fudan Excellence 2025).

miR221/222 при раке: их роль в развитии опухоли и ответе на терапию

Abstract

MiRNAs представляют собой малые некодирующие РНК длиной ~24 нуклеотида, которые могут блокировать трансляцию мРНК и/или отрицательно регулировать ее стабильность. Существует большое количество доказательств того, что нарушение регуляции miRNAs является отличительной чертой рака. miRNAs часто аберрантно экспрессируются, и их функция связана с регуляцией онкогенов и/или генов-супрессоров опухолей, участвующих в клеточном сигнальном пути. МиР-221 и миР-222 являются двумя высоко гомологичными микроРНК, активация которых была недавно описана в нескольких типах опухолей человека.Считалось, что МиР-221/222 действуют как онкогены или супрессоры опухолей, в зависимости от опухолевой системы. Подавление oncomiRs или подходы генной терапии, основанные на повторной экспрессии miRNAs, которые подавляются в раковых клетках, могут представлять собой новый противоопухолевый подход для интегрированной терапии рака. Здесь мы рассмотрим роль миР-221/222 в прогрессировании рака и их использование в качестве прогностических и терапевтических инструментов при раке.

Ключевые слова: микроРНК, рак, лечение рака. матричных РНК (мРНК) генов-мишеней.MiRNAs генерируются с помощью механизма, который обычно включает транскрипцию длинного предшественника (pri-miRNA), который затем процессируется с образованием второго предшественника (pre-miRNA) длиной 60-100 нуклеотидов с помощью ядерного белка Drosha (4). Пре-миРНК транспортируется в цитоплазму, и вторая стадия процессинга осуществляется эндорибонуклеазой семейства РНКаз III, Dicer, в результате чего образуются конечные продукты микроРНК [1]. В цитоплазме дуплексы микроРНК раскручиваются, и зрелая цепь включается в РНК-индуцированный комплекс молчания (RISC).После связывания с частично комплементарными сайтами, обычно в 3′-UTR мРНК, микроРНК вызывают ингибирование трансляции и, в некоторых случаях, деградацию мРНК-мишени (2) [2]. В геноме человека закодированы сотни микроРНК и тысячи мРНК-мишеней, и это объясняет важные регуляторные роли микроРНК в путях развития, дифференцировки, пролиферации и апоптоза клеток. Следовательно, дерегуляция miRNAs вовлечена в патогенез многих заболеваний человека, включая рак.В самом деле, как потеря, так и усиление функции miRNA способствуют развитию рака с помощью ряда различных механизмов. Поскольку miRNAs регулируют дифференцировку, пролиферацию, выживание и метастазирование раковых клеток, регуляция уровней их экспрессии может обеспечить мощную терапевтическую стратегию для инициации и прогрессирования рака. МикроРНК аберрантно экспрессируются при различных типах рака, включая лейкемию [3, 4], лимфому [5], рак молочной железы [6, 7], колоректальный рак [8], рак легкого [9, 10], гепатоцеллюлярную карциному [11, 12], и рак полости рта [13–15].Нарушение регуляции (, например, , сверхэкспрессия или потеря экспрессии) этих «раковых» микроРНК способствует возникновению и прогрессированию опухоли, способствуя неконтролируемой пролиферации и выживанию, способствуя инвазивному поведению и регулируя апоптоз [16, 17]. Затем все большее число исследований продемонстрировало, что микроРНК могут функционировать как потенциальные онкогены ( oncomiRs ) или гены-онкосупрессоры ( oncosuppressor-miRs ), в зависимости от клеточного контекста и генов-мишеней.В связи с этим miR-221/222 сверхэкспрессированы в большинстве эпителиальных опухолей [18], но они могут играть опухолесупрессирующую роль в эритролейкемических клетках, ингибируя эритропоэз посредством подавления рецептора c-Kit. Здесь мы рассмотрим современные знания о роли миР-221/222 в развитии опухоли и их потенциале в качестве диагностических, прогностических и терапевтических инструментов.

Производство микроРНК (миРНК) из пра-миРНК представляет собой сложный и скоординированный процесс, управляемый различными группами ферментов и ассоциированных белков в ядре или цитоплазме.pri-miRNA, расположенная в ядре, превращается в pre-miRNA за счет расщепляющей активности фермента Drosha. Произведенная пре-миРНК экспортируется в цитоплазму Экспортином 5. По прибытии в цитоплазму пре-миРНК процессируется в виде дуплексов микроРНК ~18–22 нуклеотидов с помощью цитоплазматической РНКазы-III Dicer. Обычно одна цепь этого дуплекса деградирует, тогда как другая цепь накапливается в виде зрелой микроРНК. Из дуплекса miRNA-miRNA только miRNA предпочтительно входит в белково-эффекторный комплекс, образованный РНК-индуцированным комплексом сайленсинга (RISC).Совершенная или почти совершенная комплементарность между miRNA и ее целевой 3’UTR индуцирует RISC расщеплять мРНК-мишень, тогда как несовершенное совпадение оснований индуцирует в основном трансляционное сайленсинг мишени.

МиР-221/222 Роль в развитии опухоли

МиР-221/222 кодируются тандемно на Х-хромосоме у человека, мыши и крысы и высококонсервативны у позвоночных. Более того, они имеют одинаковую последовательность семян. На сегодняшний день сообщалось о многих исследованиях роли miR-221/222 в развитии рака либо как oncomiR, либо как oncosuppressor-miRs (см. и ).Сверхэкспрессия miR-221/222 наблюдалась при ряде прогрессирующих злокачественных новообразований, что указывает на то, что miR-221/222 могут быть потенциальными терапевтическими мишенями при эпителиальном раке [19]. Галарди и др. , идентифицировали регулятор клеточного цикла, p27 ^Kip1 , как мишень miR-221/miR-222 [20]. Они показали, что в клетках поджелудочной железы уровни экспрессии p27 ^Kip1 и miR-221/222 обратно коррелировали, и продемонстрировали, что сверхэкспрессия miR221/222 имеет важные последствия для скорости пролиферации и распределения фаз клеточного цикла.Затем эти результаты были подтверждены при глиобластомах [21], при папиллярных карциномах щитовидной железы [22], при раке молочной железы [23], гепатоцеллюлярной карциноме [24] и раке легкого [25]. Впоследствии многие другие гены-супрессоры опухолей были идентифицированы как мишени miR-221/222. Форнари и др. , сообщили, что CDKN1C/p57 также является прямой мишенью миР-221 в печени, предполагая, что миР-221 выполняет онкогенную функцию в гепатокарциногенезе. Действительно, трансфекция миР-221 в клетки Hep3B вызывала 1.8-кратное снижение CDKN1C/p57; и наоборот, клетки SNU449, трансфицированные антимиР-221, демонстрировали 1,3-кратное увеличение уровней белка CDKN1C/p57 по сравнению с ингибиторами микроРНК отрицательного контроля [26]. Чжан и др. , сообщили, что миР-221/222 непосредственно регулируют апоптоз путем нацеливания на PUMA при глиобластоме; более того, они обнаружили обратную связь, in vivo , между PUMA и экспрессией miR-221/222 в тканях глиомы [19]. Совсем недавно мы продемонстрировали, что miR-221/222 сверхэкспрессируются у пациентов с глиомой высокой степени злокачественности и регулируют экспрессию тирозинфосфатазы PTPµ [27].Поскольку PTPμ отрицательно регулирует миграцию клеток глиомы, сверхэкспрессия miR-221/222 имеет важные последствия в онкогенезе глиомы. Более того, наши недавние данные свидетельствуют о том, что миР-221/222 также способны регулировать реакцию на темозоломид (Quintavalle, личное сообщение) путем модуляции экспрессии фермента репарации ДНК, MGMT. Снижая экспрессию MGMT, miR-221/222 делают клетки глиомы более чувствительными к темозоломиду. Следовательно, если, с одной стороны, миР-221/222 обнаруживается в высокоинвазивной опухоли со сверхэкспрессией, с другой стороны, пациенты с более высокими уровнями миР-221/222 могут лучше реагировать на терапию.Zhao et al. . обнаружили частую повышающую регуляцию миР-221/222 в ER-α-отрицательных клеточных линиях рака молочной железы и в первичных опухолях и продемонстрировали, что эти миР ингибируют трансляцию ER-α путем прямого взаимодействия с 3′-UTR. ER-α, обеспечивающих молекулярный механизм посттранскрипционной регуляции ER-α при раке молочной железы [28]. Di Leva et al продемонстрировали петлю обратной связи в miR-221/222 и ER-α. Они показали, что miR-221/222 ингибирует экспрессию факторов транскрипции ER-α и FOXO3A и что ER-α способен подавлять активацию транскрипции miR-222/221.Репрессия FOXO3 с помощью miR-221/222, в свою очередь, блокирует активацию транскрипции p27 и Bim (10). Эти данные свидетельствуют о том, что одна микроРНК благодаря своей способности модулировать различные гены, участвующие в одной и той же сети, может действовать как сильный ингибитор всего клеточного пути, что предполагает возможный больший терапевтический потенциал для микроРНК, чем для одного гена [29]. . Terasawa et al. . обнаружили, что управляемая фактором роста нервов (NGF) активация путей киназ 1 и 2 (ERK1/2, регулируемых внеклеточным сигналом) в клетках рака предстательной железы индуцирует экспрессию миР-221/222.Используя программу прогнозирования мишени, они идентифицировали проапоптотический белок Bim как потенциальную мишень miR-221/222 [30]. Функция микроРНК зависит от клеточной конкуренции. Действительно, миР-222 ингибирует инвазию клеток плоскоклеточной карциномы языка полости рта (OTSCC). Эктопическая трансфекция miR-222 снижала экспрессию матриксной металлопротеиназы 1 (MMP1) и супероксиддисмутазы марганца (SOD2), участвующих в клеточной инвазии и метастазировании, в клеточных линиях OTSCC (14). Эти результаты показывают, что miR-222 играет важную роль в инвазии OTSCC и, таким образом, может служить новой терапевтической мишенью для пациентов с высоким риском метастатического OTSCC [31].Другое исследование Felli et al. , показали, что миР-221/222 ингибируют нормальный эритропоэз и рост эритролейкемических клеток, по крайней мере, частично посредством понижающей модуляции рецептора Kit. Действительно, в эритропоэтической культуре клеток-предшественников CD34+ пуповинной крови уровни miR-221/222 заметно снижены. В эритропоэтической культуре, подвергающейся экспоненциальному росту клеток, модуляция miR обратно пропорциональна увеличению экспрессии белка Kit. Обработка предшественников CD34+ miR-221/222 способна индуцировать нарушение пролиферации и усиление дифференцировки Е-клеток [32].Эти последние два исследования доказывают супрессорную роль miR-221/222 в OTSCC и эритроцитах, снова указывая на то, что функция микроРНК исключительно зависит от клеточного соперничества и типа опухоли (14).

МиР-221/222 действуют как онкомиР путем нацеливания на важные гены-супрессоры опухолей, такие как PTEN, TIMP3, p27 ^Kip1 , p57, Bim. Сверхэкспрессия миР-221/222 индуцирует пролиферацию клеток за счет активации клеточного цикла и пути Akt и блокирует индуцируемый TRAIL апоптоз.Более того, miR-221/222 определяют устойчивость к фулвестранту посредством активации пути β-катенина.

МиР-221/222 действуют как миР-супрессоры опухолей в клетках эритропоэтической линии и плоскоклеточных клетках полости рта путем нацеливания на c-Kit, матриксную металлопротеиназу 1 (ММР1) и супероксиддисмутазу марганца (СОД2).

Таблица 1

Таблица 2

MIR-221/222 в качестве генов подавления опухоли

MIR-221/222: их роль в ответ на терапию in Cancer

Недавние исследования показывают, что химиорезистентность может быть связана с нарушением регуляции функции микроРНК. Кроме того, все больше данных указывает на существование сходства между лекарственно-устойчивыми и метастатическими раковыми клетками с точки зрения устойчивости к апоптозу и повышенной инвазивности.Сверхэкспрессия miR221/222 связана с измененным ответом на терапию рака, либо на гормональную, либо на обычную химиотерапию. Исследования показывают, что miR-221/222 играют заметную роль в приобретении устойчивости к антиэстрогенам. Рецептор эстрогена-α (ERα) играет ключевую роль в развитии и прогрессировании рака молочной железы [33]. Тамоксифен, селективный модулятор рецепторов эстрогена [34], считается эндокринной терапией первой линии, которая значительно улучшает безрецидивную и общую выживаемость ER-положительного рака молочной железы на всех стадиях [35].Однако приобретенная резистентность к тамоксифену обычно развивается после длительного лечения в большинстве первоначально чувствительных раков молочной железы [36]. Более того, почти 50% пациентов с распространенным ER-положительным раком молочной железы не реагируют на тамоксифен в условиях первой линии. Из анализа профилей экспрессии генов, регулируемых miR-221/222, выяснилось, что устойчивость к тамоксифену связана с активацией нескольких сигнальных путей фактора роста, включая рецептор 2 эпидермального фактора роста человека (HER2) и рецептор инсулиноподобного фактора роста I (IGF). -IR), которые могут «взаимодействовать» с сигнальным путем ERα.Это приводит к активации митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK) и PI3K/AKT, участвующих в выживании и пролиферации клеток [35–37]. Нокдаун миР-221 и/или миР-222 повышал чувствительность клеток MDA-MB-468 к индуцированной тамоксифеном остановке роста клеток и апоптозу. Эти данные указывают на то, что miR-221/222 играют важную роль в регуляции экспрессии ERα и могут быть потенциальными мишенями для восстановления экспрессии ERα и ответа на антиэстрогенную терапию в подмножестве рака молочной железы [28].Другие исследования демонстрируют, что miR-221/222 индуцирует резистентность к фулвестранту в чувствительных к MCF-7 клетках за счет нарушения регуляции множественных онкогенных сигнальных путей, таких как активация β-катенина и репрессия ингибирования роста, индуцированного передачей сигнала TGF-β [38] (38). ). Следовательно, воздействие на эти два онкомиР может быть потенциальной терапевтической стратегией для предотвращения развития резистентности к фулвестранту или ресенсибилизации опухолей молочной железы к этому мощному антагонисту эстрогена. Феличетти и др. , сообщили, что фактор транскрипции цинкового пальца промиелоцитарного лейкоза (PLZF) является репрессором miR-221/222 путем прямого связывания с их предполагаемой регуляторной областью.В частности, они продемонстрировали, что молчание PLZF в меланомах разблокирует миР-221/222, что, в свою очередь, усилило блокаду пролиферации и дифференцировки клеток меланомы за счет понижающей модуляции p27 ^Kip1 и рецептора c-KIT. Функциональные исследования in vitro и in vivo , включая использование антисмысловых олигонуклеотидов «antagomiR», подтвердили ключевую роль miR-221/222 в регуляции прогрессирования меланомы человека [39]. Pu и др. , недавно сообщили, что уровни miR-221 в плазме являются потенциальным биомаркером для дифференциации пациентов с колоректальным раком (CRC) от контрольной группы.Действительно, повышенный уровень miR-221 в плазме является важным прогностическим фактором общей выживаемости у пациентов с CRC и может использоваться в качестве потенциального молекулярного маркера для диагностики и прогноза CRC [40]. Чен и др. , проанализировали различные опухоли щитовидной железы и, что интересно, обнаружили сверхэкспрессию miR-221/222 в основном в папиллярных карциномах щитовидной железы [41]. Готтардо и др. , идентифицировали повышенную регуляцию миР-221 при раке мочевого пузыря по сравнению с нормальной слизистой оболочкой мочевого пузыря, подразумевая роль миР-221 в качестве прогностического инструмента также для рака мочевого пузыря [42].Наша группа показала, что в клетках НМРЛ, устойчивых к TRAIL, уровни миР-221/222 повышены. Трансфекция анти-миР-221 и -222 делала клетки, устойчивые к CALU-1, чувствительными к TRAIL; и наоборот, h560-чувствительные клетки, обработанные miR-221/222, становятся TRAIL-резистентными. Мы сообщили, что miR-221/222 мешают передаче сигналов TRAIL главным образом через p27 ^kip1 (10). Таким образом, высокие уровни экспрессии miR-221/222 необходимы для поддержания устойчивого к TRAIL фенотипа, что делает эти miR многообещающими диагностическими инструментами для устойчивости к TRAIL при НМРЛ [25].Более того, интересная петля регуляции miR-221/222 и чувствительности TRAIL была недавно описана Acunzo et al. , [43]. Фактически, сообщалось, что сверхэкспрессия miR-130 способна подавлять экспрессию miR-221/222 посредством понижающей модуляции MET. Это открытие показало, как miR-130a, воздействуя на MET, способна снижать экспрессию miR-221/222 и, соответственно, устойчивость к TRAIL в клетках NSCLC, и убедительно подтверждает участие miR-221/222 в регуляции чувствительности к TRAIL.

Действительно, стратификацию опухоли на основе уровней экспрессии miR-221/222 можно использовать в качестве прогностического инструмента для прогнозирования TRAIL-чувствительности или TRAIL-резистентности при лечении НМРЛ [25].

miR-221/222 в качестве терапевтического средства

В нескольких сообщениях указывается, что miR-221/222 можно использовать в качестве терапевтического средства для модулирования резистентности или чувствительности к противораковым агентам. Наша группа недавно обнаружила, что МЕТ посредством активации транскрипции Jun повышает экспрессию миР-221/222, которая, в свою очередь, путем нацеливания на PTEN и TIMP3 придает устойчивость к TRAIL-индуцированной гибели клеток и повышает туморогенность клеток рака легких и печени [44]. ].PTEN представляет собой липидфосфатазу, которая непосредственно противодействует активности фосфатидилинозитол-3-ОН киназы (PI3K) [45]. Его инактивация приводит к конститутивной активации пути PI3K/AKT и последующему увеличению синтеза белка, прогрессии клеточного цикла, миграции и, что наиболее важно, выживаемости [46]. TIMP3 принадлежит к семейству тканевых ингибиторов металлопротеиназ (TIMP), в которое входят четыре члена семейства (TIMP1–4) [47]. Они ингибируют активность металлопротеиназ (ММР), связываясь с активным центром в соотношении 1:1 [48], но другие исследования показали, что TIMP3 способствует апоптотической гибели клеток [49, 50].

Другое исследование Chun-Zi et al. , продемонстрировали, что миР-221 и миР-222 регулируют радиочувствительность, рост клеток и инвазию клеток желудка, посредством прямой модуляции экспрессии PTEN [51]. Эти результаты позволяют предположить, что ингибирование миР-221 и миР-222 может формировать разработана новая терапевтическая стратегия не только для повышения чувствительности опухолевых клеток к апоптозу, вызываемому лекарственными препаратами, но и для подавления их выживания, пролиферации и инвазивных способностей.

Недавно Pineau et al., [52] идентифицировали индуцируемый повреждением ДНК транскрипт 4 (DDIT4), модулятор пути mTOR, в качестве мишени miR-221. Они вводили в клетки рака печени LNA-модифицированные антимиР-221 и антимиР-222. Лечение антагомиР, но не скремблированными олигонуклеотидами, уменьшало рост клеток рака печени, которые сверхэкспрессировали миР-221/222. Таким образом, использование синтетических ингибиторов miR-221 может оказаться многообещающим подходом к лечению рака печени [52]. Галарди и др. показали, что нокдаун miR-221/222 с помощью антисмысловых олигонуклеотидов LNA увеличивает p27 ^Kip1 в клетках рака предстательной железы человека (PC3) и сильно снижает их клоногенность в in vitro , тогда как модель ксенотрансплантата у мышей SCID продемонстрировала, что эктопическая сверхэкспрессия miR- 221 может дать большое преимущество в росте.Соответственно, лечение установленных подкожных опухолей антаго-миР 222/221 снижает рост опухоли за счет увеличения внутриопухолевого количества p27 [20]. Интересно, что Ван и др. . сконструировали аденовирусно-экспрессируемые shRNAs, которые функционально ко-репрессируют экспрессию miR-221/222 в клетках глиобластомы, повышая уровни экспрессии p27, вызывая остановку клеточного цикла в фазе G1 и апоптоз [53]. Наконец, Погрибный и др. , изучали роль изменений микроРНК в приобретении устойчивого к цисплатину фенотипа в клетках аденокарциномы молочной железы человека MCF-7.Они идентифицировали в общей сложности 103 микроРНК (46 с повышенной экспрессией и 57 с пониженной экспрессией) в клетках MCF-7, устойчивых к цисплатину. Среди наиболее активно регулируемых miR они обнаружили miR-221/222, участвующую в контроле передачи клеточных сигналов и выживании клеток [54]. Наши недавние данные демонстрируют, что miR-221 и -222 активируются в стволовых клетках рака молочной железы, полученных от пациентов или из культивируемых клеток MCF7, выращенных в суспензии (личное сообщение Condorelli). Их роль в поведении раковых стволовых клеток находится в стадии изучения.

МиР-221/222 способствует эпителиально-мезенхимальному переходу путем нацеливания на Notch4 в клеточных линиях рака молочной железы

Notch4 сверхэкспрессируется в люминальных клетках рака молочной железы и имеет обратную корреляцию с миР-221/222

Наше более раннее исследование показало, что Notch4 поддерживает люминальный фенотип и подавляет метастазирование опухоли при раке молочной железы. Как показано на рис. 1а, высокие уровни мРНК Notch4 были специфически экспрессированы в ERα-положительных клеточных линиях просветного рака молочной железы MCF-7 и T-47D, но не в ERα-отрицательных клеточных линиях рака молочной железы MDA-MB-231, БТ-549 и СК-БР-3.Вестерн-блоттинг показал, что как полноразмерный, так и внутриклеточный домен (ICD) Notch4 в основном экспрессировались в люминальных эпителиальных фенотипах клеточных линий MCF-7 и T-47D, о чем свидетельствует повышенная экспрессия ERα и E-кадгерина (рис. 1b). Однако экспрессия Notch4 не была обнаружена в клеточных линиях базальноподобного рака молочной железы MDA-MB-231, BT-549 и SK-BR-3, которые экспрессируют мезенхимальный маркер виментин (рис. 1б).

miR-221/222 имеют обратную корреляцию с Notch4 в клетках рака молочной железы. a qRT-PCR анализ экспрессии мРНК Notch4 в клеточных линиях рака молочной железы. b Полноразмерный эндогенный Notch4 (FL) и внутриклеточный домен (ICD), уровни белка ERα, E-кадгерина и виментина в клеточных линиях рака молочной железы. c, d Базы данных для прогнозирования генов-мишеней миР-221/222 и выравнивания последовательностей исходных областей миР-221 и миР-222 человека с 3’UTR Notch4, который содержит предполагаемый сайт связывания миР-221/222. e qRT-PCR анализ экспрессии миР-221/222 в клеточных линиях рака молочной железы , базы данных miRWalk и RNAhybrid) для идентификации предполагаемых микроРНК, нацеленных на Notch4.Среди идентифицированных микроРНК-кандидатов 3′-UTR Notch4 человека содержит области, которые соответствуют начальным последовательностям hsamiR-221 и hsamiR-222 (Fig. 1c, d). Кроме того, мы исследовали эндогенные уровни miR-221/222 с помощью qRT-PCR. Экспрессия обеих миРНК была почти неопределяемой в просветных клетках рака молочной железы MCF-7 и T47D, но миР-221/222 была высоко экспрессирована в базальноподобных клетках подтипов SKBR3, MDA-MB-231 и BT549 (рис. 1e). . Поскольку наши данные показали обратную корреляцию между миР-221 или миР-222 и экспрессией Notch4 в клетках рака молочной железы, мы предположили, что Notch4 может быть мишенью миР-221/222.

МиР-221/222 подавляют экспрессию белка Notch4 и индуцируют ЭМП

Чтобы изучить роль миР-221 и миР-222 в регуляции Notch4 и ЭМП, мы трансфицировали синтетические олигомиметики миР-221 и миР-222 в грудную клетку MCF-7. раковые клетки. Экспрессия обеих микроРНК увеличивалась примерно в 1000 раз через 48 ч трансфекции миметиками (рис. 2а). С помощью qRT-PCR мы обнаружили, что уровень мРНК Notch4 не изменился в клетках, трансфицированных miR-221 или miR-222, по сравнению с контрольной группой (рис.2б). Напротив, сверхэкспрессия miR-221/222 значительно снижала уровни эндогенного Notch4 (как полноразмерного, так и ICD), ERα, p27 и белка E-кадгерина (Fig. 2c). Напротив, добавление ингибиторов miR-221/222 к клеткам MDA-MB-231 (рис. 2d) значительно индуцировало экспрессию ICD Notch4 и E-кадгерина, в то время как экспрессия виментина значительно снижалась. Как и ожидалось, p27 и ERα, являющиеся мишенями miR221/222, также активировались ингибированием miR-221/222 (рис. 2f). Интересно, что уровни мРНК Notch4 не изменились в клетках, трансфицированных ингибитором miR-221/222 (фиг.2e), указывая на то, что miR-221/222 регулируют Notch4 только на уровне трансляции. Чтобы дополнительно подтвердить роль miR221/222 в регуляции Notch4, мы временно трансфицировали клетки MCF-7 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-221/222, а также пустым вектором pcDNA6.2-GW/EmGFP. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что уровни Notch4 были в значительной степени снижены в клетках, экспрессирующих miR-221/222, по сравнению с клетками, трансфицированными только GFP, или нетрансфицированными клетками (рис. 2g).

Notch4 является мишенью миР-221/222 в клетках рака молочной железы. a Уровни экспрессии миР-221 и миР-222 определяли с помощью qRT-PCR после принудительной трансфекции миметиков миР-221 или миР-222 в клетки MCF-7. b qRT-PCR мРНК Notch4 после принудительной трансфекции миметиков miR-221 и miR-222 в клетки MCF-7. c Вестерн-блот анализ уровней эндогенного белка Notch4, ERα, p27 и E-кадгерина в клетках MCF-7 после эктопической экспрессии миметиков miR-221/222 в клетках MCF-7. d, e qRT-PCR эндогенной мРНК miR-221/222 и Notch4 в клетках MDA-MB-231 после трансфекции ингибиторами miR-221/222. f Вестерн-блот анализ уровней белка N3FL, N3ICD, ERα, p27 и виментина после трансфекции ингибиторами miR-221/222 в клетках MDA-MB-231. г Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток MCF-7, транзиентно трансфицированных вектором GFP (экспрессирующим только GFP), GFP-miR-221 или GFP-miR-222 с использованием антитела против Notch4. Сигналы Notch4 (красные) в клетках, трансфицированных миР-221 и миР-222, помечены стрелками. DAPI, 4′,6-диамидино-2-фенилиндол

МиР-221 и миР-222 напрямую нацелены на 3’UTR Notch4, чтобы ингибировать экспрессию Notch4

Чтобы подтвердить, что Notch4 является прямой мишенью миР-221/222, репортер Notch4 типа (WT) pMIR-Notch4-3’UTR WT или контрольный репортер был совместно трансфицирован с AgomiR221/222 (миметиками) в клетки MCF-7, которые экспрессируют низкие уровни miR-221 и miR-222 (фиг.3а). Как и ожидалось, агомиР-221 и агомиР-222 снижали активность люциферазы репортера Notch4 примерно на 50~80% в клетках MCF-7 дозозависимым образом, в то время как на контрольный репортер это не влияло (рис. 3b, c). . Точно так же активность люциферазы также снижалась с помощью AgomiR-221/222, что было визуализировано с помощью биолюминесцентной визуализации и последующей количественной оценки (рис. 3d-g). Для дальнейшего изучения того, регулирует ли miR-221/222 непосредственно Notch4 путем нацеливания на сайт связывания семян GTGTAGCT, мы совместно трансфицировали pMIR-Notch4 3’UTR WT или мутированные репортеры с миметиками и ингибиторами miR-221/222 (antagomiR-221/222). в указанных концентрациях в клетках MCF-7.Интересно, что дозозависимый ингибирующий эффект miR-221/222 на активность 3’UTR Notch4 устранялся за счет коэкспрессии ингибиторов miR-221/222. Однако при использовании мутантного репортера Notch4 3’UTR не наблюдалось существенных изменений активности люциферазы (рис. 3з, и). Напротив, ингибиторы miR-221/222 повышали активность люциферазы в клетках MDA-MB-231 дозозависимым образом при совместной трансфекции с репортером pMIR-Notch4-3’UTR WT. Повышенная активность люциферазы обращалась при совместной экспрессии с миметиками miR-221/222 (фиг.3к, к). Таким образом, эти результаты подтверждают биоинформатическое предсказание, что Notch4 является прямой мишенью miR-221 и miR-222.

МиР-221/222 напрямую нацеливается на Notch4 3’UTR. a Схематический репортер люциферазы, содержащий предсказанные последовательности Notch4 дикого типа (WT) или его мутантные 3’UTR для миР-221/222. b, c Клетки MCF-7 котрансфицировали репортерами pMIR-Notch4-3’UTR WT или pMIR control в присутствии AgomiR-221/222 (10, 30 и 90  нМ) или miR-control (NC ).Активность Fluc/Rluc измеряли через 48 ч после трансфекции и нормализовали к соответствующему контролю вектора. Каждую трансфекцию проводили в трех повторностях, и эксперимент повторяли трижды. Данные представляют собой среднее значение ± SEM. *** Р   <  0,001. d, e Клетки MCF-7 , стабильно трансфицированные pMIR-Notch4-3’UTR, обрабатывали AgomiR-221/222 в указанных концентрациях или вектором pMIR-control, и активность люциферазы определяли через 48 ч после трансфекции методом молекулярной визуализации устройство (IVIS KINETIC). f, g Количественное определение активности люциферазы при трансфекции агомиР-221 и агомиР-222 в системе IVIS KINETIC. ч, i Клетки MCF-7 котрансфицировали репортерами pMIR-Notch4-3’UTR дикого типа (WT) или pMIR-Notch4-3’UTRmutant (мутант) в присутствии AgomiR-221/222 (10 , 30 нМ) и антагомиР-221/222 (10, 30 нМ) или миР-контроль (НК). Активность Fluc/Rluc измеряли через 48 ч после трансфекции и нормализовали к соответствующему контролю вектора. j, k Клетки MDA-MB-231 котрансфицировали репортерами pMIR-Notch4-3’UTR в присутствии антагомиR-221/222 (10, 30 нМ) и AgomiR-221/222 (10, 30 нМ ) или miR-контроль (NC).Активность Fluc/Rluc измеряли через 48 ч после трансфекции и нормализовали к соответствующему контролю вектора. Каждую трансфекцию проводили в трех повторностях, и эксперимент повторяли трижды. Данные представляют собой среднее ± SEM

МиР-221/222 индуцируют ЭМП за счет подавления Notch4

Плазмиды GFP-миР-222. Вестерн-блоттинг показал, что сверхэкспрессия миР-221 или миР-222 снижает экспрессию Notch4, ERα и E-кадгерина в клетках MCF-7 (фиг.4а). Впоследствии мы исследовали, вызывает ли сверхэкспрессия миР-221/222 морфологические изменения, связанные с ЕМТ в клетках MCF-7. Клетки MCF-7, трансфицированные miR-221 и miR-222, демонстрировали фибробластоподобную морфологию и демонстрировали рассеяние клеток по сравнению с контрольными клетками, которые сохраняли фенотип булыжника с сильной межклеточной адгезией (рис. 4b). Затем мы исследовали, влияют ли миР-221 и миР-222 на клеточную миграцию и инвазию в клетки рака молочной железы. Сообщалось, что миР-221/222 способствуют пролиферации рака человека.Чтобы устранить эти воздействия, бессывороточная среда использовалась в анализе заживления ран и анализе трансвелла (дополнительная фигура 1A – D). В анализе заживления ран сверхэкспрессия миР-221 или миР-222 в клетках MCF-7 приводила к примерно 2-кратному увеличению скорости миграции клеток по сравнению с контрольной группой через 48 часов в культуре (рис. 4c, d и дополнительные). Рисунок 1Е). Более того, анализы Transwell, покрытые матригелем (для инвазии) или непокрытые (для миграции), показали, что сверхэкспрессия миР-221 и миР-222 резко увеличивает миграцию (примерно в 2 раза) и инвазивность (в 5 раз) клеток MCF-7. линия; при сверхэкспрессии N3ICD путем транзиторной трансфекции увеличение инвазии и миграции практически полностью подавлялось (рис.4д-з). И наоборот, экспрессия ингибиторов миР-221 или миР-222 в клетках MDA-MB-231 снижала скорость миграции примерно на 50% по сравнению с контрольной группой через 24 часа (рис. 5а, б). Клетки MDA-MB-231, обработанные ингибитором миР-221 или миР-222, демонстрировали значительно сниженные миграционные и инвазивные способности по сравнению с контрольными клетками (рис. 5в, г). Эти результаты подтверждают, что miR-221 и miR-222 способствуют миграции и инвазии за счет ингибирования экспрессии Notch4.

Сверхэкспрессия N3ICD изменяет продвижение EMT miR-221 и miR-222 в клетках MCF-7.Вестерн-блоттинг и показывает, что клетки MCF-7, стабильно трансфицированные векторами GFP-miR-221 и GFP-miR-222, подавляли ICD Notch4 и ERα, а также E-кадгерин. b Влияние сверхэкспрессии miR-221/222 на морфологию клеток оценивали с помощью фазово-контрастной микроскопии (×100). Шкала баров представляет 50   мкм. c, d Репрезентативные микрофотографии (×40) анализа заживления ран в клетках MCF-7. Клетки фотографировали для измерения длины раны через 0 и 48 часов. Продолжительность заживления раны измеряли в 5 случайных полях.Данные представляют собой среднее значение трех повторных экспериментов   ±   SEM. e–h Репрезентативные микрофотографии (×200) анализов миграции и инвазии Transwell. Стабильно трансфицированные клетки miR-221/222 MCF-7 котрансфицировали N3ICD или контрольной плазмидой. Вторгшиеся или мигрирующие клетки подсчитывали в 5 случайных полях. Данные представляют собой среднее значение трех повторных экспериментов   ±   SEM. Масштабные полосы представляют собой 50 мкм

Ингибирование миР-221/222 снижает миграцию и способность к инвазии в клетках рака молочной железы MDA-MB-231. a, b Репрезентативные панели из анализа ран с царапинами в клетках MDA-MB-231, визуализированные под микроскопом. Клетки MDA-MB-231 трансфицировали ингибитором miR-221/222 или miR-контролем. Заживление ран измеряли в 5 случайных полях. Данные представляют собой среднее значение трех повторных экспериментов   ±   SEM. c, d Репрезентативные микрофотографии (×200) анализов Transwell с покрытием или без покрытия в клетках MDA-MB-231, трансфицированных ингибиторами miR-221/222 или miR-NC. Клетки фотографировали для измерения длины раны через 0 и 24 часа.Вторгшиеся или мигрирующие клетки подсчитывали в пяти случайных полях. Данные представляют собой среднее значение трех повторных экспериментов   ±   SEM. Шкала баров представляет 50   мкм. * P   <  0,05; ** Р   <  0,01; *** P   <  0,001

Границы | МикроРНК-221/222 опосредует индуцированную ADSC-экзосомой кардиозащиту от ишемии/реперфузии путем нацеливания на PUMA и ETS-1

Введение

Для пациентов с инфарктом миокарда (ИМ) тромболизис или чрескожное коронарное вмешательство (ЧКВ) являются своевременным и эффективным методом реперфузии миокарда, который может уменьшить острое ишемическое повреждение миокарда и ограничить размер ИМ (Hausenloy and Yellon, 2013).Хотя безопасная кардиохирургическая техника может улучшить хирургические результаты, сам процесс реперфузии может вызвать гибель клеток сердца, известную как повреждение сердечной ишемии/реперфузии (I/R) (Dhalla et al., 2000; Hausenloy and Yellon, 2013). И/Р-повреждение включает в себя ряд сложных событий, включая повышенный окислительный стресс, индуцированное воспаление, запуск апоптоза и гипертрофии миокарда, и может усугубить повреждение сердца и составлять до 50% размера инфаркта (Yellon and Hausenloy, 2007; Heusch et al., 2007). др., 2013; Сантос-Гальего и др., 2016). Хотя были предприняты усилия, чтобы понять механизмы, вызывающие повреждение сердца при И/Р, молекулярные и клеточные события, которые регулируют повреждение сердца после И/Р, до сих пор изучены лишь частично. Таким образом, необходимы новые фармакологические вмешательства для предотвращения повреждения И/Р и потенциального улучшения клинических исходов у пациентов с острым ИМ, перенесших ЧКВ (Heusch and Gersh, 2017; Li Y. et al., 2019).

Стволовые клетки жировой ткани (ADSC) играют жизненно важную роль в заживлении ран.Недавние исследования показали, что экзосомы, мембранные липидные нановезикулы диаметром 30–100 нм, секретируемые стволовыми клетками, способствуют паракринной передаче сигналов (Hu et al., 2016; Eguchi et al., 2019). Экзосомы этих клеток обладают преимуществами высокой стабильности, неиммунного отторжения, самонаведения и легкого контроля дозы и концентрации (Hu et al., 2016). Однако прямых доказательств механизма их действия нет. Согласно предыдущим исследованиям, экзосомы являются важными медиаторами передачи межклеточного сигнала, так как в экзосомах имеется множество микроРНК (миРНК) и белков (Waldenström and Ronquist, 2014).miRNA представляют собой небольшие (∼22 nt) некодирующие РНК, которые отрицательно регулируют экспрессию кодирующих белок генов путем ингибирования трансляции мРНК (Valencia-Sanchez et al., 2006). Экспрессия miRNA связана с сердечными событиями, такими как передача электрических сигналов, сокращение мышц, рост сердца и морфогенез (Yang et al., 2007; Zhao et al., 2007). Все больше данных указывает на то, что изменения в профилях экспрессии микроРНК часто можно обнаружить при сердечных заболеваниях, таких как ИМ и сердечная недостаточность (Abdellatif, 2012).Следовательно, возможно манипулировать микроРНК для достижения терапевтических эффектов (Barraclough et al., 2019). миР-221 и миР-222 (кластеры миР-221/222) имеют одну и ту же «исходную» последовательность, эволюционно консервативные и короткие участки на своих 5′-концах, через которые они связываются со своими сайтами-мишенями в 3′-нетранслируемой области (UTR) мРНК. (Сонг и др., 2017). Этот кластер не регулируется при раке человека, атеросклеротическом ремоделировании сосудов и вирусном миокардите (Чистяков и др., 2015; Corsten et al., 2015).МиР-221/222 нацеливается на активируемый p53 модулятор апоптоза (PUMA) и действует как регулятор апоптоза эпителиальных клеток (Zhang et al., 2010). miR-221/222 также нацеливается на протоонкоген 1 ETS (ETS-1) (Zhu et al., 2011). Однако роль миР-221/миР-222 в сердце во время И/Р до сих пор неизвестна, и дальнейшие исследования все еще продолжаются. Предыдущие исследования показали, что PUMA и ETS-1 могут регулировать апоптоз и гипертрофию соответственно (Zhan et al., 2005; Mandl et al., 2011). Принимая во внимание все эти факторы, цель этого исследования состояла в том, чтобы изучить, может ли miR-221/222 участвовать в регуляции апоптоза и гипертрофии клеток миокарда H9c2, а также ИМ путем нацеливания на PUMA и ETS-1.Наши результаты показывают, что PUMA и ETS-1 участвуют в индуцированном H ₂ O ₂ апоптозе и гипертрофии путем снижения экспрессии miR-221/222 в клетках H9c2. Сверхэкспрессия миР-221/222 противодействует этим явлениям в клеточных моделях и мышиных моделях I/R. Мы также обнаружили, что экзосомы, полученные из ADSC, могут снижать клеточный апоптоз и клеточную гипертрофию, что полезно при повреждении I/R. Эти данные обеспечивают убедительные доказательства того, что ADSC-Exo имеет перспективы клинического применения для лечения И/Р.

Материалы и методы

самца мышей C57BL/6 дикого типа (WT) и мышей с нокаутом miR-221/222 (KO) (масса тела: 25–30 г; возраст: 8–12 недель). Мы создали мышей miR-221/222 KO путем удаления X-сцепленного гена miR-221/222 и скрещивали их в течение 10 поколений на фоне C57BL/6. Мышей анестезировали изофлураном, а сердце подвергали И/Р хирургии. Короче говоря, ишемия была достигнута путем лигирования передней нисходящей ветви левой передней нисходящей коронарной артерии (LAD) нейлоновым швом 7-0 и размещения силиконовой трубки (наружный диаметр 86 мм) на 1 мм ниже нее.Эффективность окклюзии проверяли побелением желудочка на дистальном конце перевязки. Затем через 25 мин после окклюзии ADSC-Exo (100 мкг белка в 50 мкл) равномерно внутримышечно вводили в пограничную зону передней стенки левого желудочка в пяти позициях. Через 30 мин окклюзии силиконовую трубку удаляли для реперфузии. После 30 мин ишемии и 3 ч реперфузии всех мышей повторно анестезировали и вскрывали грудную клетку. Образцы сердца и крови были получены для дальнейшего анализа.В плацебо-группе сердце обнажали без перевязки ПМЖВ. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями по уходу за животными Национального тайваньского университета (утверждение IACUC №: 20150502) и в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, публикация NIH № 86–23, пересмотренная в 1985 г.

Физиологическая оценка сердечной функции

Влияние И/Р и ADSC-Exo на сердечную функцию оценивали с помощью эхокардиографии. Эхокардиографию выполняли с помощью специальной ультразвуковой системы высокого разрешения для мелких животных (Prospect, S-Sharp, Тайбэй, Тайвань), оснащенной одноэлементным преобразователем с частотой 40 МГц.Записи в М-режиме, записанные на уровне папиллярной мышцы левого желудочка в проекции по длинной оси, использовались для оценки фракционного укорочения (FS) и фракции выброса (EF).

Культура клеток

Эмбриональные клетки H9c2, полученные из сердца крысы, были приобретены в Американской коллекции типовых культур (VA, США) и культивированы в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM, GIBCO, NY, United States) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) , 110 мг/мл пирувата натрия, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°C во влажной атмосфере, содержащей 5% CO ₂ .Если не указано иное, клетки обрабатывали 50 мкМ H ₂ O ₂ в течение 48 часов. Клетки H9c2 предварительно обрабатывали ADSC-Exo (2 мкг/мл) в течение 4 часов, а затем обрабатывали 50 мкМ H ₂ O ₂ в течение 48 часов. Человеческие ADSC были приобретены у LONZA (Базель, Швейцария). ADSC культивировали в среде DMEM, содержащей 20% FBS и пенициллин/стрептомицин. Для всех экспериментов использовали клетки между пассажами 3 и 8.

Экстракция, очистка и характеристика ADSC-Exo

ADSC обрабатывали трипсином и высевали по 5 × 10 ⁵ клеток в 10-сантиметровую чашку.Через 24 часа культуральную среду собирали и центрифугировали при 3000 g в течение 15 минут для удаления клеток и клеточного дебриса. ADSC-Exo выделяли из 10 мл культуральной среды с использованием 2 мл ExoQuick-TC ^TM Exosome Precipitation Solution в соответствии с инструкциями производителя (System Biosciences, CA, США). После инкубации в течение ночи при 4°С смесь центрифугировали при 10000 g в течение 30 мин при 4°С. Осадок промывали 1 мл PBS и центрифугировали при 4°C в течение 15 мин при 10 000 g .Затем очищенные ADSC-Exos полностью суспендировали в 50 мкл PBS и хранили при -80°C для дальнейшего изучения. Содержание белка в экзосомах определяли количественно с использованием метода Бредфорда. Очищенный ADSC-Exo характеризовали с использованием биомаркеров CD63 и CD9 с помощью вестерн-блоттинга. Морфологию и размер ADSC-Exo наблюдали под просвечивающим электронным микроскопом (Hitachi, Токио, Япония). Анализ отслеживания наночастиц (NTA) использовали для оценки концентрации и распределения размеров ADSC-Exo.Подробные методы и результаты характеристики ADSC-Exo были описаны в дополнительных данных. Сердечный и клеточный захват ADSC-Exo исследовали с использованием набора для мечения PKH-26 (Sigma, Миссури, США) и наблюдали под конфокальным микроскопом.

Обнаружение лактатдегидрогеназы (ЛДГ)

Повреждение миокарда оценивали путем измерения уровня ЛДГ в крови. Использовали коммерческий набор для анализа ЛДГ (Abcam, Массачусетс, США). Все процедуры проводились в соответствии с инструкциями производителя.

Измерение производства активных форм кислорода (АФК)

2′,7′-дихлордигидрофлуоресцеиндиацетат (DCFDA) (Thermo, Массачусетс, США) и дигидроэтидий (DHE) (Invitrogen, Массачусетс, США) использовали для определения уровней внутриклеточных окислительных свободных радикалов и супероксидных анионов соответственно. Криостатные срезы сердца инкубировали с 2 мкМ ДГЭ в темноте при 37°С в течение 20 мин. Клетки H9c2 окрашивали DCFDA (10 мкМ) в темноте при 37°C в течение 1 часа.Окислительный стресс исследовали и наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа. Интенсивность флуоресценции DHE дополнительно определяли количественно с помощью ImageJ (NIH, MD, United States), а относительную экспрессию выражали как кратность изменения по сравнению с контролем.

Оценка апоптоза с помощью TdT-опосредованного анализа dUTP Nick End-Labeling (TUNEL)

Для изучения апоптоза использовали парафиновые срезы толщиной 5 микрометров образцов сердца, полученных при И/Р, или культивируемых кардиомиоцитов. В соответствии с инструкциями производителя апоптоз выявляли с помощью набора для анализа TUNEL ( In Situ Cell Death Detection Kit, Roche, CA, США).Процент TUNEL-положительных ядер по отношению к общему количеству ядер определяли вслепую путем расчета пяти случайно выбранных 40-кратных полей зрения на каждом покровном стекле на каждом предметном стекле. Кроме того, окрашивание TUNEL использовали для оценки апоптоза клеток H9c2 с помощью проточной цитометрии.

Вестерн-блот-анализ

выполняли, как описано ранее (Liang et al., 2011). Сердце измельчали ​​в жидком азоте и гомогенизировали в буфере RIPA (TOOLS, New Taipei City, Тайвань) с добавлением смеси ингибиторов протеазы (Genestar Biotechnology, Тайвань).Кроме того, для приготовления клеточных лизатов клетки лизировали в буфере RIPA со смесью ингибиторов протеаз при 4°C в течение 1 ч с последующим центрифугированием при 14000 g в течение 15 мин при 4°C, супернатант сохраняли. Равное количество супернатанта (20 мкг белка) подвергали 10% SDS-PAGE, а затем переносили на мембрану PVDF (Merck, Нью-Джерси, США). Затем мембрану инкубировали с 5% обезжиренным молоком в трис-буферном солевом растворе, содержащем 0,2% Tween 20 (TBST), в течение 1 ч при комнатной температуре (КТ).Блоты инкубировали с первичными антителами следующим образом: ETS-1, PUMA и CD9 были приобретены у Abcam, CD73 и CD63 были приобретены у GeneTex (Hsinchu, Тайвань), HIF-1α и фосфорилированный p53 были приобретены у Cell Signaling (MA, США), BCL-2 был приобретен у BD (Калифорния, США), а ANP был приобретен у Санта-Крус (Техас, США) в течение ночи при 4°C. Затем клетки инкубировали с конъюгированными с пероксидазой хрена козьими антителами против IgG кролика в течение 1 ч (Jackson ImmunoResearch, CA, США).Chemiluminescence Reagent Plus (NEN, Массачусетс, США) использовали для проявления сигнала, а изображения получали с помощью системы визуализации Biospectrum 600 (UVP, Калифорния, США). Количественную оценку интенсивности каждой полосы выполняли с помощью ImageJ. В качестве контроля загрузки использовали антитело против GAPDH (Proteintech, IL, США).

Окрашивание агглютинином зародышей пшеницы (WGA)

Сердце разрезали пополам, формируя поперечный срез между атриовентрикулярной бороздой и верхушкой.Базовый образец фиксировали в 10% формалиновом буфере, заливали в парафин и разрезали на срезы толщиной 5 мкм. Площадь поперечного сечения кардиомиоцитов измеряли на изображениях, полученных в срезах, окрашенных 5 мкМ WGA (Thermo, MA, США). Клетки H9c2 подвергали воздействию 50 мкМ H ₂ O ₂ или указанной обработке в течение 48 часов. После фиксации 4% параформальдегидом клетки инкубировали с 5 мкМ WGA в течение 10 мин при комнатной температуре. Изображения наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа. Площадь поверхности измеряли с помощью ImageJ для проверки гипертрофии, и значение выражали как кратное изменение по сравнению с контролем.

Измерение объема клетки

H9c2 обрабатывали 50 мкМ H ₂ O ₂ в течение 48 ч или указанной обработкой, а затем трипсинизировали и суспендировали в PBS для анализа проточной цитометрии. Объем клеток анализировали в режиме прямого рассеяния (FSC) с помощью проточной цитометрии, и значение выражали как изменение объема (%) по сравнению с необработанной группой. Кроме того, клетки, подвергнутые указанным обработкам, фотографировали с помощью инвертированного микроскопа. Изображения были подвергнуты измерению площади поверхности с помощью ImageJ, и значение было выражено как кратное изменение по сравнению с контролем.

Иммуноокрашивание

Культивированные клетки или парафиновые срезы сердца инкубировали со специфическими первичными антителами (разведение 1:100 для антитела против PUMA, 1:100 для антитела против ETS-1) при 4°C в течение ночи. Затем срезы инкубировали с конъюгированными с биотином козьими антикроличьими IgG (разведение 1:200; Vector Lab, Соединенное Королевство) в течение 1 ч при комнатной температуре. Наконец, реакцию развивали с помощью DAB, клетки докрашивали гематоксилином и исследовали с помощью световой микроскопии.

Выделение РНК и количественная ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR)

Тотальную РНК выделяли из клеток с использованием реагента TRIzol (Thermo) в соответствии с инструкциями производителя.Для получения матрицы кДНК использовали набор TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Invitrogen, CA, США). Для анализа экспрессии miR-221/222 проводили RT-qPCR с использованием TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA, США). Наборы для анализа микроРНК TaqMan для miR-221 (000524), miR-222 (002276) и RNU6B (001973) были получены от Applied Biosystems. Все реакции проводили в трехкратной повторности. Количество миР-221/222 определяли путем стандартизации по сравнению с RNU6B.

Преходящая трансфекция

клеток H9c2 высевали в 6-луночный планшет в концентрации 3 × 10 ⁵ клеток на лунку и трансфицировали специфическими миметиками miR-221/222 (100 нМ) (Dharmacon, CO, США) или меченными FAM миметиков (GenePharma, Шанхай, Китай) или ингибитора дуплексной РНК (Dharmacon) с использованием реагента Lipofectamine 3000 в соответствии с протоколом производителя с последующим анализом экспрессии ETS-1 и PUMA, апоптоза и гипертрофии.Нецелевые последовательности использовали в качестве отрицательного контроля.

PUMA или ETS-1 осуществляли с помощью специфической siRNA (1 мкМ) с использованием липофектамина 3000. Понижающая регуляция ETS-1 и PUMA была подтверждена вестерн-блоттингом. Кроме того, у Dharmacon были приобретены полноразмерные кДНК, кодирующие ETS-1 и PUMA крысы. Транзиторную трансфекцию клеток H9c2 проводили с помощью реагента Lipofectamine 3000.

Трансфекцию in vivo проводили с помощью реагента для трансфекции TurboFect in vivo (Thermo), а миметики или ингибиторы miR-221/222 (50 пмоль) готовили в концентрации 50 мкл в соответствии с инструкциями производителя.Процесс трансфекции in vivo следовал протоколу I/R с инъекцией ADSC-Exo. Смесь миметиков или ингибиторов по 50 мкл равномерно вводили внутримышечно в пограничную зону передней стенки левого желудочка в пяти позициях.

Репортерный анализ люциферазы

Плазмиды репортерного гена люциферазы WT и мутантного (MUT) PUMA 3’UTR были созданы компанией Promega (WI, США). Затем клетки котрансфицировали миметиками miR-NC или miR-221/222 с репортерной плазмидой WT или MUT PUMA 3’UTR с использованием реагента Lipofectamine 3000.После 48-часовой инкубации при 37°C для измерения относительной активности люциферазы использовали систему анализа двойной люциферазы (Promega). Кроме того, компания Promega создала WT и MUT плазмид репортерного гена люциферазы ETS-1 3’UTR. Подобные процедуры были выполнены, как описано выше.

Аннексин V/йодид пропидия (PI) Двойное окрашивание

клеток H9c2 высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 3×10 ⁵ клеток на лунку. После проведения различных обработок в разных группах процент апоптотических клеток определяли с помощью набора для обнаружения апоптоза (BD) Annexin V-FITC/PI в соответствии с протоколом производителя и исследовали с помощью проточного цитометра FACSCanto II (BD).Аннексин V-положительные и PI-отрицательные популяции представляют собой ранние апоптотические клетки, в то время как аннексин V-положительные и PI-положительные популяции представляют поздние апоптотические клетки. Согласно предыдущему отчету, эти популяции обычно выбирают в качестве клеток апоптоза (Xiao et al., 2016).

Статистика

Количественные данные были получены из указанного количества экспериментов и выражены как среднее ± стандартное отклонение. Различия между 2 группами рассчитывали с помощью теста Стьюдента t .Статистическую значимость различий между несколькими экспериментальными группами определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Dunnett . Для анализа данных использовали SPSS (версия 17.0; IBM, штат Нью-Йорк, США). Значение P <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Кардиопротекторные эффекты ADSC-Exo были связаны со снижением апоптоза и гипертрофии при И/Р-индуцированном повреждении сердца

В первой серии экспериментов мы исследовали, улучшает ли ADSC-Exo сердечную функцию у мышей I/R.На рисунке 1А показаны репрезентативные изображения в М-режиме от контрольных мышей, мышей, получавших I/R, и мышей, получавших ADSC-Exo I/R. Уровень КВ и ФС у животных И/Р был заметно снижен по сравнению с таковыми у контрольных животных. Напротив, EF и FS у мышей, получавших ADSC-Exo, были значительно повышены по сравнению с таковыми у мышей, получавших I/R. Высвобождение ЛДГ является индикатором повреждения клеток. Как показано на рисунке 1В, после 30-минутной ишемии миокарда с последующей реперфузией в течение 3 часов высвобождение ЛДГ в плазме в группе И/Р значительно увеличилось.ADSC-Exo значительно снижал высвобождение ЛДГ. Окислительный стресс играет решающую роль в индуцированном И/Р повреждении сердца. Поэтому мы попытались изучить влияние ADSC-Exo на продукцию АФК. Как показано на рисунке 1C, ДГЭ-положительные клетки явно присутствовали в группе I/R. ADSC-Exo значительно снизил производство АФК. Точно так же вестерн-блоттинг был использован для подтверждения того, что I / R увеличивает экспрессию HIF-1α, а ADSC-Exo снижает экспрессию HIF-1 (рис. 1D).

Рисунок 1. Лечение ADSC-Exo ослабляло индуцированный И/Р апоптоз и гипертрофию миокарда in vivo .Мышей подвергали ишемии в течение 30 мин с последующей реперфузией в течение 3 ч. В мышиной модели I/R + ADSC-Exo через 25 мин после окклюзии ADSC-Exo (100 мкг белка в 50 мкл) равномерно внутримышечно вводили в пять позиций в пограничной зоне передней стенки левого желудочка, а затем перфузировали в течение 3 час (A) Репрезентативные изображения в М-режиме от контрольных мышей, мышей, получавших I/R, и мышей, получавших ADSC-Exo I/R. Фракция выброса левого желудочка (EF) и фракционное укорочение (FS) у мышей I/R, получавших ADSC-Exo, были значительно увеличены по сравнению с мышами, получавшими I/R. (B) Уровень высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ). (C) Измерение внутриклеточных АФК с помощью окрашивания ДГЭ. Масштабная линейка, 125 мкм. Показан количественный анализ флуоресценции ДГЭ. (D) Вестерн-блот анализ уровня экспрессии HIF-1α. (E) Влияние ADSC-Exo на апоптоз после И/Р повреждения миокарда с помощью анализа TUNEL. (F) Показан количественный анализ площади поперечного сечения кардиомиоцитов с помощью окрашивания WGA. Срезы сердца окрашивали с помощью окрашивания WGA и определяли площадь поперечного сечения кардиомиоцитов.Был проведен анализ изображений клеток относительной площади поверхности клеток (размера клеток). Масштабная линейка, 50 мкм. (G) Уровни BCL2, p-p53, каспазы-3 и белка ANP оценивали с помощью вестерн-блоттинга. Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 3). * P <0,05 по сравнению с контрольной группой; ^† P <0,05 по сравнению с группой I/R.

Затем мы исследовали наличие или отсутствие апоптоза и гипертрофии кардиомиоцитов, обработанных ADSC-Exo I/R.I/R индуцировал значительный апоптоз, в то время как ADSC-Exo снижал этот эффект, что было обнаружено с помощью анализа TUNEL (рис. 1E). Кроме того, окрашивание WGA показало, что I/R индуцирует гипертрофию клеток, в то время как ADSC-Exo уменьшает гипертрофию по сравнению с таковой в группе I/R (рис. 1F). В дополнение к прямому обнаружению апоптоза и гипертрофии кардиомиоцитов с помощью окрашивания TUNEL и WGA, дальнейшие исследования молекулярных механизмов включают обнаружение маркеров апоптоза (таких как p-p53, каспаза-3 и BCL2) и маркеров гипертрофии (таких как ANP).Как показано на рисунке 1G, лечение I / R значительно снижало уровни BCL2 и увеличивало экспрессию p-p53, каспазы-3 и ANP, в то время как лечение ADSC-Exo значительно обращало этот эффект.

ADSC-Exo защищен от И/Р-повреждения миокарда у мышей с помощью миР-221/222

miR-221/222 была заметно снижена в сердцах, обработанных I/R, с помощью RT-qPCR. Введение ADSC-Exo в миокард значительно увеличивало экспрессию миР-221/222 (рис. 2А). ADSC-Exo явно присутствовали в тканях сердца (рис. 2В).Биоинформатический анализ с использованием программы прогнозирования целевых микроРНК «miRanda» показал, что PUMA и ETS-1 являются потенциальными генами-мишенями для miR-221/222. В частности, 3′-UTR мРНК PUMA и мРНК ETS-1 содержат предполагаемые сайты связывания miR-221/222. Двойной репортерный анализ люциферазы подтвердил, что миР-221/222 нарушала люциферазную активность 3′-UTR PUMA и 3′-UTR ETS-1 (WT) дикого типа, но не 3′-UTR MUT PUMA и ETS-1 в клетки (рис. 2C). Как показано на рисунке 2D, окрашивание PUMA и ETS-1 не наблюдалось с помощью иммуногистохимии в контрольной группе, тогда как сильное окрашивание наблюдалось на тканях сердца в группе лечения I/R.Напротив, введение ADSC-Exo приводило к более слабому окрашиванию PUMA и ETS-1 у мышей, получавших I/R. Точно так же данные были дополнительно подтверждены вестерн-блоттингом (рис. 2Е). Результаты показали, что уровни белка PUMA и ETS-1 повышались при обработке И/Р, в то время как ADSC-Exo уменьшал экспрессию в ответ на И/Р.

Рис. 2. ADSC-Exo защищает от И/Р повреждения миокарда у мышей с помощью миР-221/222. Мышей подвергали ишемии в течение 30 мин с последующей реперфузией в течение 3 ч.На модели мышей I/R+ADSC-Exo через 25 мин после окклюзии ADSC-Exo (100 мкг белка в 50 мкл) равномерно внутримышечно вводили в пограничную зону передней стенки левого желудочка в пяти точках с последующим реперфузия в течение 3 часов. (A) Уровни miR-221/222 определяли с помощью RT-qPCR. (B) ADSC-Exo, меченный PKH-26 (красный), присутствовал в тканях сердца. (C) Потенциальные сайты связывания miR-221/222 в 3′-UTR мРНК PUMA и ETS-1. Анализ активности люциферазы при котрансфекции 3’UTR PUMA дикого типа (PUMA-WT) или 3’UTR PUMA мутантного типа (PUMA-MUT) с миметиками miR-221/222 или отрицательным контролем (скремблирование).Кроме того, анализ активности люциферазы клеток, котрансфицированных 3′-UTR ETS-1 дикого типа (ETS-1-WT) или 3′-UTR ETS-1 мутантного типа (ETS-1-MUT) с миметиками miR-221/222 или отрицательный контроль (скрембл). (D) Экспрессия PUMA и ETS-1 в тканях сердца, обнаруженная с помощью иммуногистохимии. Положительный продукт реакции обозначался коричневой окраской. Ядра докрашивали раствором гематоксилина. (E) Вестерн-блот анализ уровней экспрессии PUMA и ETS-1.Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 3). GAPDH использовали в качестве контроля. * P < 0,05 по сравнению с контрольной группой; ^† P <0,05 по сравнению с группой I/R.

ADSC-Exo снижает апоптоз и гипертрофию в клетках H9c2

Чтобы лучше понять защитный механизм ADSC-Exo от повреждения миокарда I/R, кардиомиоциты H9c2, обработанные H ₂ O ₂ , использовали для имитации повреждения миокарда I/R in vitro .Хорошо известно, что окислительный стресс является важным фактором, вызывающим апоптоз и гипертрофию кардиомиоцитов (Tsutsui et al., 2011). Клетки H9c2 подвергались воздействию различных концентраций H ₂ O ₂ от 25 до 400 мкМ, и H ₂ O ₂ снижала жизнеспособность клеток в зависимости от концентрации (данные не показаны). Меченые РХ36 экзосомы поглощались клетками H9c2 (рис. 3А). Клетки H9c2, обработанные 50 мкМ H ₂ O ₂ в течение 24 ч, увеличивали продукцию АФК, в то время как ADSC-Exo значительно снижала продукцию АФК согласно анализу DCFDA (рис. 3В).Кроме того, уровни апоптоза были обнаружены путем окрашивания аннексином V/PI с помощью проточной цитометрии (рис. 3C). H ₂ O ₂ вызывал усиление апоптоза, тогда как ADSC-Exo уменьшал апоптоз. Апоптоз был дополнительно подтвержден анализом TUNEL, и лечение ADSC-Exo уменьшило апоптоз, индуцированный H ₂ O ₂ (рис. 3D). Кроме того, H ₂ O ₂ вызывал гипертрофию клеток, тогда как обработка ADSC-Exo снижала гипертрофию клеток (рис. 3E). Поскольку обработка ADSC-Exo увеличивала экспрессию miR-221/222 в сердцах, обработанных I/R, мы оценили, защищает ли miR-221/222 кардиомиоциты от H ₂ O ₂ , индуцированных апоптозом и гипертрофией.Согласно результатам RT-qPCR, уровни miR-221/222 были значительно снижены в группе лечения H ₂ O ₂ по сравнению с контрольной группой, в то время как ADSC-Exo увеличивал экспрессию miR-221/222 (рис. 3F). . Кроме того, по сравнению с ADSC, ADSC-Exo содержит большое количество миР-221 и миР-222 (рис. 3G). Для дальнейшего изучения вовлеченных молекулярных механизмов были измерены уровни экспрессии апоптотических белков и маркеров гипертрофии (таких как p-p53, BCL2 и ANP).Как показано на рисунке 3H, лечение H ₂ O ₂ значительно повышало уровни p-p53 и ANP и снижало уровни BCL2, в то время как присутствие ADSC-Exo значительно ослабляло повышение уровней p-p53. и АНП. Кроме того, вестерн-блоттинг показал, что обработка H ₂ O ₂ может повышать уровни экспрессии PUMA и ETS-1. Напротив, ADSC-Exo снижал экспрессию. В совокупности эти данные показывают, что введение ADSC-Exo приводит к снижению апоптоза и гипертрофии, индуцированных H ₂ O ₂ .Эти результаты показывают, что миР-221/222 является эффективным регулятором апоптоза и гипертрофии кардиомиоцитов.

Рисунок 3. ADSC-Exo ослаблял H ₂ O ₂ -индуцированный апоптоз и гипертрофию путем подавления экспрессии PUMA и ETS-1 в клетках H9c2. Кардиомиоциты предварительно обрабатывали ADSC-Exos (2 мкг/мл) или без него в течение 4 часов, а затем подвергали воздействию 50 мкМ H ₂ O ₂ в течение 48 часов. (А) Экзосомы, меченные РХ36 (красные), были поглощены клетками H9c2.Синий цвет представляет ядро ​​клетки. Масштабная линейка, 100 мкм. (B) H ₂ O ₂ увеличивал продукцию ROS, в то время как ADSC-Exo значительно снижал продукцию ROS согласно анализу DCFDA. Зеленый цвет представляет ROS-положительные клетки. Масштабная линейка, 100 мкм. (C) Анализ апоптотических клеток методом проточной цитометрии с окрашиванием аннексином V/PI. (D) Апоптоз исследовали с помощью анализа TUNEL. Зеленые, TUNEL-положительные ядра; синий, ядра. Показан количественный анализ гибели клеток.Обработка ADSC-Exo уменьшала апоптоз, индуцированный H ₂ O ₂ . Масштабная линейка, 100 мкм. (E) H ₂ O ₂ вызывали гипертрофию клеток, а обработка ADSC-Exo уменьшала гипертрофию клеток при наблюдении с помощью инвертированного микроскопа. Показан количественный анализ площади поверхности клеток. Масштабная линейка, 50 мкм. (F) По сравнению с таковыми в контрольной группе уровни миР-221/222 в группе лечения H ₂ O ₂ были значительно снижены, на что указывает RT-qPCR, в то время как ADSC-Exo увеличивал экспрессию . (G) Уровни miR-221/222 в ADSC были значительно выше, чем в клетках H9c2. Важно отметить, что уровни миР-221/222 в ADSC-Exo были значительно выше, чем в ADSC. клетки. (H) Уровни маркеров апоптоза (p-p53, BCL2 и PUMA) и маркеров гипертрофии (ETS-1 и ANP) исследовали вестерн-блоттингом. GAPDH использовали в качестве контроля загрузки. Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 3). * P < 0,05 против.контрольная группа; ^† P < 0,05 по сравнению с H ₂ O ₂ .

миР-221/222 участвовала в ADSC-экзо-опосредованном ингибировании апоптоза и гипертрофии в H

Чтобы продемонстрировать влияние миР-221/222 на апоптоз и гипертрофию, уровни экспрессии маркера апоптоза PUMA и маркера гипертрофии ETS-1 измеряли в кардиомиоцитах, трансфицированных миметиками миР-221/222. Миметики miR-221/222 значительно снижали экспрессию PUMA и повышали экспрессию BCL2 в кардиомиоцитах, обработанных H ₂ O ₂ (фиг. 4A).Анализ TUNEL, оцененный с помощью флуоресцентной микроскопии или проточной цитометрии, и окрашивание аннексина V/PI, оцененное с помощью проточной цитометрии, показали, что трансфекция миметиками miR-221/222 также значительно снижает апоптоз, индуцированный H ₂ O ₂ , по сравнению с таковым в контрольной группе. (Рисунки 4B-D). Индуцированный апоптоз Нокдаун PUMA в клетках H9c2, подвергшихся воздействию H ₂ O ₂ , значительно увеличивал экспрессию BCL2 и снижал апоптоз (рис. 4A–E). Кроме того, миметики miR-221/222 значительно снижали экспрессию ETS-1 в кардиомиоцитах, обработанных H ₂ O ₂ (рис. 4F).Более того, трансфекция миметиком miR-221/222 также значительно снижала гипертрофию, индуцированную H ₂ O ₂ , посредством экспрессии ANP и проточной цитометрии (Рисунки 4F, G). Нокдаун ETS-1 в клетках H9c2, подвергшихся воздействию H ₂ O ₂ , снижал экспрессию ANP и гипертрофию клеток (рис. 4G, H). Сверхэкспрессия PUMA была подтверждена иммунофлуоресцентным окрашиванием, а трансфекция миметиков miR-221/222 снижала экспрессию PUMA (рис. 4I). Анализ TUNEL показал, что трансфекция миметиков miR-221/222 снижает апоптоз, индуцированный сверхэкспрессией PUMA (рис. 4I, J).Сверхэкспрессия ETS-1 также была подтверждена иммунофлуоресцентным окрашиванием, которое показало, что трансфекция миметиков miR-221/222 снижает экспрессию ETS-1 (рис. 4K). Трансфекция миметиком miR-221/222 снижала гипертрофию, вызванную сверхэкспрессией ETS-1, по сравнению с таковой в контрольной группе (рис. 4K, L). Следовательно, эти результаты показывают, что miR-221/222 регулирует экспрессию PUMA и ETS-1, которые участвуют в апоптозе и гипертрофии.

Рисунок 4. miR-221/222 участвовала в ADSC-Exo-опосредованном ингибировании H ₂ O ₂ -индуцированного апоптоза и гипертрофии кардиомиоцитов.Клетки H9c2 трансфицировали миметиками miR-221/222 или siRNA, нацеленными на PUMA и ETS-1, в течение 48 часов, а затем подвергали воздействию 50 мкМ H ₂ O ₂ в течение 48 часов. (A) Вестерн-блот-анализ уровней белков PUMA и BCL2 с использованием миметиков miR-221/222 или миРНК PUMA. (B–D) Трансфекция миметиками miR-221/222 или миРНК PUMA значительно снижала апоптоз, индуцированный H ₂ O ₂ , по данным анализа TUNEL с использованием флуоресцентной микроскопии (B) или проточной цитометрии ( C) и окрашивание аннексином V/PI с использованием проточной цитометрии (D) . (E) Нокдаун PUMA в клетках H9c2, подвергшихся воздействию H ₂ O ₂ , увеличивал экспрессию BCL2 и снижал апоптоз. (F) Миметики miR-221/222 значительно снижали экспрессию ETS-1 и ANP в кардиомиоцитах, обработанных H ₂ O ₂ . (G) Трансфекция миметиками miR-221/222 также значительно снижала гипертрофию, индуцированную H ₂ O ₂ , по данным проточной цитометрии. Прямое рассеяние (FSC) представляет размер ячейки. (H) Нокдаун ETS-1 в клетках H9c2, подвергшихся воздействию H ₂ O ₂ , снижал экспрессию ANP с помощью вестерн-блоттинга. (I) Сверхэкспрессия PUMA была подтверждена иммунофлуоресцентным окрашиванием, а трансфекция миметиками miR-221/222 снижала экспрессию PUMA. (J) Апоптоз, индуцированный сверхэкспрессией PUMA, согласно анализу TUNEL, в то время как трансфекция имитаторами miR-221/222 снижала апоптоз. (K) Сверхэкспрессия ETS-1 была подтверждена иммунофлуоресцентным окрашиванием, а трансфекция миметиками miR-221/222 снижала экспрессию ETS-1. (L) Сверхэкспрессия ETS-1 индуцировала гипертрофию, в то время как трансфекция миметиками miR-221/222 обращала этот эффект.Показан количественный анализ площади поверхности клеток. Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 3). * P <0,05 по сравнению с контрольной (нелеченой) группой; ^† P < 0,05 по сравнению с H ₂ O ₂ .

ADSC-Exo снижает апоптоз и гипертрофию в H

Появляется все больше доказательств того, что AKT/NFκB играет критическую роль в апоптозе и гипертрофии (Zhao et al., 2015; Луо и др., 2019). Кардиомиоциты культивировали отдельно или обрабатывали H ₂ O ₂ . По сравнению с контрольными клетками клетки H9c2, обработанные H ₂ O ₂ , снижали уровни фосфорилированной AKT, в то время как клетки, обработанные ADSC-Exo, увеличивали экспрессию p-AKT (фиг. 5A). Трансфекция миметиков miR-221/222 также значительно увеличивала H ₂ O ₂ -восстановленное фосфорилирование AKT (фиг. 5B). Чтобы выяснить, необходима ли активация пути AKT для воздействия ADSC-Exo на апоптоз и гипертрофию клеток H9c2, обработанных H ₂ O ₂ , во время лечения H ₂ O ₂ использовали активатор AKT SC79. .SC79 снижал H ₂ O ₂ -индуцированную экспрессию PUMA и ETS-1 в клетках H9c2 (рис. 5C, D). Кроме того, также исследовали экспрессию NFκB в клетках H9c2, обработанных H ₂ O ₂ . Как показано на фигуре 5E, H ₂ O ₂ увеличивало фосфорилирование NFκB p65 по сравнению с таковым в контрольных клетках, тогда как ADSC-Exo снижало экспрессию p-p65. Трансфекция миметиков miR-221/222 также значительно снижала увеличение фосфорилирования p65 с помощью H ₂ O ₂ (рис. 5F).Чтобы подтвердить роль NFκB в индуцированных ADSC-Exo антиапоптотических и антигипертрофических эффектах в клетках H9c2, клетки обрабатывали H ₂ O ₂ с ингибитором NFκB Bay 11-7082 или без него (Bay 11). Как показано на фиг. 5G, H, ингибитор NFκB снижал экспрессию PUMA и ETS-1 в обработанных H ₂ O ₂ клетках H9c2. Анализ TUNEL и окрашивание WGA, оцениваемые с помощью флуоресцентной микроскопии, показали, что лечение активатором AKT или ингибитором NFκB также снижает апоптоз и гипертрофию кардиомиоцитов, обработанных H ₂ O ₂ (рис. 5I, J).SC79 снижал фосфорилирование NFκB, в то время как Bay 11 не влиял на фосфорилирование AKT (рис. 5K, L). Кроме того, по сравнению с контрольным лечением лечение I/R значительно снижало p-AKT и увеличивало p-p65 по сравнению с тем, что ADSC-Exo обращал эти эффекты in vivo (рис. 5M, N). Лечение активатором AKT или ингибитором NFκB также снижало экспрессию PUMA и ETS-1 у мышей, получавших I/R (рис. 5O, P). В совокупности эти данные указывают на то, что ADSC-Exo с miR-221/222 предотвращает сердечное повреждение I / R через путь AKT / NFκB.

Рис. 5. ADSC-Exo снижает апоптоз и гипертрофию в клетках H9c2, обработанных H ₂ O ₂ , посредством пути AKT/NFκB. Кардиомиоциты предварительно обрабатывали ADSC-Exos (2 мкг/мл) или без него в течение 4 часов, а затем подвергали воздействию 50 мкМ H ₂ O ₂ в течение 48 часов. (A) Влияние на AKT исследовали в клетках H9c2, обработанных H ₂ O ₂ . H ₂ O ₂ снижал фосфорилирование AKT по сравнению с таковым в контрольных клетках, в то время как ADSC-Exo увеличивал экспрессию AKT, как показывает вестерн-блоттинг. (B) Трансфекция миметиков miR-221/222 значительно улучшила H ₂ O ₂ -снижение фосфорилирования AKT. (C,D) Предварительная обработка SC79 (10 мкМ) в течение 1 ч снижала H ₂ O ₂ -индуцированную экспрессию PUMA и ETS-1 в клетках H9c2. (E) Экспрессию NFκB в клетках H9c2, обработанных H ₂ O ₂ , исследовали с помощью вестерн-блоттинга. H ₂ O ₂ увеличивал фосфорилирование NFκB p65 по сравнению с таковым в контрольных клетках, тогда как ADSC-Exo снижал экспрессию p-p65. (F) Трансфекция миметиков miR-221/222 значительно снижала повышенное фосфорилирование p65 с помощью H ₂ O ₂ . (G, H) Предварительная обработка ингибитором NFκB (Bay 11, 2,5 мкМ) в течение 1 ч снижала H ₂ O ₂ -индуцированную экспрессию PUMA и ETS-1 в клетках H9c2. (I,J) Предварительная обработка SC79 или Bay 11 в течение 1 часа уменьшала апоптоз и гипертрофию в кардиомиоцитах, обработанных H ₂ O ₂ , что было обнаружено с помощью анализа TUNEL и окрашивания WGA соответственно.Показан количественный анализ TUNEL-положительных клеток или площади клеточной поверхности. (K,L) SC79 уменьшал фосфорилирование NFκB, в то время как Bay 11 не влиял на фосфорилирование AKT. (M, N) И/Р лечение значительно снижало p-AKT и повышало p-p65 по сравнению с таковым у контрольных мышей, в то время как ADSC-Exo обращал эти эффекты in vivo . (O,P) У мышей, получавших SC79 (10 мг/кг) или Bay 11 (80 мг/кг), наблюдалось снижение экспрессии PUMA и ETS-1 у мышей, получавших I/R.Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 3). * P <0,05 по сравнению с контролем; ^† P < 0,05 по сравнению с H ₂ O ₂ .

ADSC-Exo защищает от повреждения I/R миокарда у мышей miR-221/222 KO

Наблюдалось значительное увеличение экспрессии PUMA и ETS-1 после обработки I/R у мышей miR-221/222 KO, а ADSC-Exo ослаблял индуцированную I/R активацию PUMA и ETS-1 (рис. 6A, B). ). Кроме того, лечение ADSC-Exo уменьшало апоптоз и гипертрофию в кардиомиоцитах, на что указывал анализ TUNEL и окрашивание WGA, соответственно, у мышей miR-221/222 KO, получавших I/R (рис. 6B-D).В соответствии с результатами лечения ADSC-Exo трансфекция миР-221/222 значительно снижала апоптоз в соответствии с анализом TUNEL и гипертрофию в соответствии с окрашиванием WGA по сравнению с таковым в группе I/R (рис. 6E). Кроме того, уровни PUMA и ETS-1 в группе I/R повышались, в то время как уровни в группе I/R + mimic-miR-221/222 восстанавливались (рис. 6F). Точно так же этот результат был подтвержден с помощью иммуногистохимии (рис. 6G). Напротив, в группе ингибиторов I/R+ADSC-Exo+miR-221/222 не наблюдалось снижения апоптоза и гипертрофии по сравнению с группой I/R (рис. 6H).Экспрессия PUMA и ETS-1 повышалась в группе I/R, и на нее не влияла группа ингибиторов I/R+ADSC-Exo+ miR-221/222 (рис. 6I). Результаты были подтверждены иммуногистохимией (рис. 6J). Эти данные убедительно подтверждают, что ADSC-Exo может предотвращать I/R повреждение миокарда посредством miR-221/222 in vivo .

Рис. 6. ADSC-Exo оказывает защитное действие на повреждение миокарда I/R у мышей miR-221/222 KO. Мышей miR-221/222 KO подвергали ишемии в течение 30 минут с последующей реперфузией в течение 3 часов.В модели мышей miR-221/222 KO, обработанных I/R + ADSC-Exo, через 25 мин после окклюзии ADSC-Exo (100 мкг белка в 50 мкл), миметики или ингибиторы miR-221/222 (50 пмоль в 50 мкл). мкл) вводили внутримышечно равномерно в пограничную зону передней стенки левого желудочка в пяти позициях с последующей реперфузией в течение 3 ч. (A) Уровни белка PUMA и ETS-1 оценивали с помощью вестерн-блоттинга. (B) Влияние ADSC-Exo на экспрессию PUMA и ETS-1 у мышей miR-221/222 KO. (C, D) Эффекты ADSC-Exo на апоптоз и гипертрофию исследовали с помощью анализа TUNEL и окрашивания WGA, соответственно, у мышей miR-221/222 KO. Показаны результаты количественного анализа TUNEL-положительных клеток или площади клеточной поверхности. (E) Влияние трансфекции миметиков miR-221/222 на апоптоз и гипертрофию исследовали с помощью анализа TUNEL и окрашивания WGA, соответственно, у мышей WT и miR-221/222 KO. Показан количественный анализ TUNEL-положительных клеток или площади клеточной поверхности. (F, G) Влияние трансфекции миметиков miR-221/222 на экспрессию PUMA и ETS-1 исследовали с помощью вестерн-блоттинга и иммуногистохимии у мышей WT и miRNA-221/222 KO. (H) Влияние трансфекции ингибиторов миР-221/222 на апоптоз и гипертрофию исследовали с помощью анализа TUNEL и окрашивания WGA, соответственно, у мышей дикого типа. Показаны результаты количественного анализа TUNEL-положительных клеток и площади клеточной поверхности. (I,J) Влияние трансфекции ингибиторов миР-221/222 на экспрессию PUMA и ETS-1 исследовали вестерн-блоттингом и иммуногистохимией на мышах дикого типа.Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 3). Коричневый цвет: апоптотические клетки; синий цвет: ядра. Красный или зеленый цвет: граница ячейки. * P < 0,05 по сравнению с контрольной группой; ^† P <0,05 по сравнению с группой I/R. Масштабная линейка, 50 мкм.

Обсуждение

Апоптоз и гипертрофия кардиомиоцитов являются важными компонентами И/Р-индуцированного повреждения сердца. В этом исследовании мы обнаружили, что миокардиальный апоптоз и экспрессия белка, связанного с гипертрофией, увеличивались после лечения И/Р.Однако лечение экзосомами из ADSC обратило эти эффекты вспять. Мы также продемонстрировали, что кардиозащитные эффекты достигаются за счет большого количества миР-221/222, нацеленного на белки PUMA и ETS-1.

Потеря кардиомиоцитов во время И/Р миокарда в основном связана с гибелью клеток и ишемическим стрессом в выживших миоцитах, что запускает ремоделирование левого желудочка и приводит к гипертрофии (Konstantinidis et al., 2012). Гибель клеток в первую очередь вызывается апоптозом и некрозом. Кроме того, гипертрофия сердца характеризуется увеличением размеров отдельных кардиомиоцитов.Хотя изначально гипертрофия считалась компенсаторной реакцией на баланс давления стенки во время систолы, появляется все больше экспериментальных данных о том, что гипертрофия активирует дезадаптивные клеточные процессы и способствует прогрессированию заболевания (Bisping et al., 2014). Действительно, гипертрофия сердца является мощным и независимым фактором риска неблагоприятного прогноза сердечно-сосудистых заболеваний (Hawkins et al., 2007). Поскольку кардиомиоциты окончательно дифференцированы и имеют небольшой потенциал для деления, снижение апоптоза и гипертрофии кардиомиоцитов после повреждения имеет потенциальную терапевтическую ценность (Brown and Griendling, 2015).Предыдущие исследования показали, что PUMA и ETS-1 способствуют апоптозу и гипертрофии кардиомиоцитов соответственно (Zhou et al., 2016; Li Y. et al., 2017). Несколько исследователей предложили различные пути апоптоза кардиомиоцитов путем активации PUMA, p53-чувствительного белка Bh4 (Yang et al., 2014, 2019). Отсутствие PUMA уменьшало размер инфаркта изолированных перфузируемых сердец, получавших И/Р (Toth et al., 2006). Абляция PUMA ослабляла сердечную дисфункцию в модели сердечной недостаточности у мышей за счет уменьшения апоптоза (Mandl et al., 2011). Подавление PUMA может ингибировать апоптоз in vivo и защищать от неонатального гипоксически-ишемического повреждения головного мозга. Кроме того, патологический процесс гипертрофии кардиомиоцитов тесно связан с экспрессией ETS-1. Инфузия Ang II вызывала увеличение размера сердца и толщины стенки желудочка у мышей, но эти эффекты были значительно уменьшены у мышей с глобальным нокаутом ETS-1 (Zhan et al., 2005; Xu et al., 2019). Наше текущее исследование показывает, что добавление H ₂ O ₂ к культивируемым кардиомиоцитам может повысить уровни PUMA и ETS-1, а ингибирование PUMA и ETS-1 может уменьшить апоптоз и гипертрофию соответственно.Мы также показываем, что I / R увеличивает миокардиальный апоптоз и гипертрофию с помощью окрашивания TUNEL и WGA соответственно. Более того, лечение И/Р значительно снижает уровень BCL2 и увеличивает экспрессию p-p53, каспазы-3, PUMA (маркеры апоптоза), ANP и ETS-1 (маркеры гипертрофии), в то время как лечение ADSC-Exo значительно обращает этот эффект. ADSC-Exo уменьшает апоптоз и гипертрофию и может быть полезен при повреждениях, вызванных И/Р.

Мезенхимальные стволовые клетки больше подходят для лечения ишемических заболеваний, поскольку они связаны с меньшим количеством этических проблем, более высокой способностью к самообновлению и более низкой иммуногенностью.В наших исследованиях ранее сообщалось о потенциальной эффективности мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека при восстановлении повреждения сосудов (Wang et al., 2009; Shen et al., 2013; Liang et al., 2015). Кроме того, ADSC привлекательны тем, что их легко получить, они быстро размножаются in vitro и могут быть собраны из большого количества жировой ткани. Важно отметить, что недавнее исследование показало, что наблюдаемые терапевтические эффекты в первую очередь опосредованы секрецией стволовых клеток (Harrell et al., 2019).Экзосомы являются наиболее эффективными активными паракринными компонентами, играют важную роль в межклеточных коммуникациях и обладают большим потенциалом для восстановления поврежденных тканей (Lai et al., 2010). Экзосомы несут сложные микроРНК и белки и могут влиять на многие клеточные процессы и пути (Théry et al., 2009). Прошлые исследования показали, что экзосомы, полученные из МСК, играют ключевую роль в защите от повреждения сердца и почек, вызванного И/Р (Lin et al., 2016; Zhang et al., 2016). Кроме того, экзосомы потенциально безопаснее, поскольку их применение осуществимо и снизит затраты на производство и хранение.ADSC-Exo играет полезную роль, увеличивая миграцию эндотелиальных клеток пупочной вены человека и формируя капиллярные сети in vitro (Han et al., 2018). Наше предыдущее исследование показало, что лечение ADSC-Exo увеличивает выживаемость лоскута и плотность капилляров по сравнению с таковым при И/Р через путь IL-6 (Pu et al., 2017). Другое исследование также показало, что ADSC-Exo защищает миокард от повреждения I/R посредством пути Wnt/β-catenin (Cui et al., 2017). Мы обнаружили, что ADSC-Exo может поглощаться и интернализоваться кардиомиоцитами для ингибирования апоптоза и гипертрофии за счет снижения экспрессии PUMA и ETS-1 в культивируемых кардиомиоцитах, обработанных H ₂ O ₂ , и мышах, получавших I/R.Основываясь на этих выводах, ADSC-Exo можно использовать для терапевтического регулирования функции кардиомиоцитов.

О нарушении регуляции экспрессии микроРНК сообщалось в многочисленных исследованиях, затрагивающих различные патофизиологические процессы, включая И/Р и сердечную недостаточность (Barraclough et al., 2019). В этих исследованиях ранее сообщалось, что miR-221/222 играет важную роль в воспалении, сердечно-сосудистой функции и тканевом метаболизме (Chistiakov et al., 2015; Song et al., 2017; Verjans et al., 2018).miR-221/222 очень распространена в ADSC-Exo и будет выбрана для дальнейших исследований. miR-221 и miR-222 являются высоко гомологичными микроРНК, кодируемыми на Х-хромосоме, и образуют кластеры miR-221-222 (Song et al., 2017). По сравнению со здоровым контролем экспрессия miR-221-3p и miR-222-3p была значительно снижена у пациентов с атеросклерозом, что позволяет предположить, что подавление этих двух микроРНК может быть связано с атеросклеротическим процессом (Zhang et al., 2014). Аро Е регулирует экспрессию р27 посредством миР-221/222, что ограничивает пролиферацию гладкомышечных клеток (Kothapalli et al., 2013). Экспрессия мРНК ICAM-1 увеличивается, в то время как экспрессия miR-221 снижается в аорте и сердце (Duan et al., 2013). Системное ингибирование miR-221/222 in vivo приводит к тяжелому поражению сердца, увеличению вирусной нагрузки на сердце и длительной виремии при вирусном миокардите (Corsten et al., 2015). Используя предсказания биоинформатики, сайты комплементарного связывания miR-221/222 были идентифицированы в 3′-UTR мРНК PUMA и мРНК ETS-1, которые обладают антиапоптотическими и антигипертрофическими свойствами соответственно.Сверхэкспрессия miR-221/222 в глиобластоме индуцирует выживание клеток, тогда как нокдаун этих miR приводит к усилению апоптоза путем активации PUMA (Zhang et al., 2010). В этом исследовании мы обнаружили, что условия I/R или H ₂ O ₂ снижают уровни экспрессии miR-221/222. Лечение экзосомами, содержащими большое количество миР-221/222, или трансфекция миР-221/222 значительно снижала экспрессию PUMA и ETS-1, что свидетельствует о том, что ADSC-Exo может уменьшать индуцированное I/R повреждение миокарда путем подавления PUMA и ETS-1. 1.Мы продемонстрировали, что miR-221/222 может действовать как вышестоящий регулятор PUMA и ETS-1, тем самым регулируя клеточные апоптотические и гипертрофические процессы.

Патогенез повреждения сердца включает множественные внутриклеточные сигнальные каскады, включая пути ROS, AKT и фактора транскрипции (NF-kB) (Ma et al., 2014). Учитывая участие ADSC-Exo в снижении индуцированного I/R апоптоза и гипертрофии, регулирование этих сигналов имеет большое значение. Сигнальный путь AKT играет важную роль в предотвращении повреждения I/R, регулируя проапоптотические сигналы, воспаление и АФК (Li Q.и др., 2019). Апоптоз клеток, вызванный окислительным стрессом, обусловлен дисфункцией AKT и активацией NFκB (Wang et al., 2019). JNK/NFκB участвует в миокардиальном I/R-индуцированном апоптозе (Zhang et al., 2019). TNF-α активирует NF-κB посредством образования АФК и пути AKT, чтобы предотвратить гибель кардиомиоцитов (Tang et al., 2018). Было показано, что ингибитор NFκB Bay 11-7082 ингибирует ремоделирование левого желудочка после ИМ (Wang et al., 2017). Другое исследование подтвердило, что фосфорилирование AKT было значительно снижено в сердце мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров, после травмы I/R (Samidurai et al., 2019). Эффект экспрессии AKT и p-p65 считается потенциальной терапевтической мишенью при сердечном и/р повреждении (Yuan et al., 2015). В соответствии с некоторыми из этих предыдущих исследований, p-AKT был снижен, а p-p65 повышен в клетках H9c2, обработанных H ₂ O ₂ , и в сердцах, обработанных I/R, в настоящем исследовании. Мы также продемонстрировали, что активатор AKT и ингибитор NF-κB значительно снижают экспрессию PUMA и клеточный апоптоз. Они также снижали экспрессию ETS-1 и гипертрофию клеток.Предыдущие исследования показали, что продукция цитокинов, регулируемая микроРНК, опосредована модулированием AKT/NF-κB (Zhao et al., 2019). miRNA-29a регулирует липополисахарид-индуцированные воспалительные реакции в мышиных макрофагах посредством пути Akt1/NF-κB (Tang et al., 2017). миР-221/222 способствует свойствам раковых стволовых клеток и росту опухоли рака молочной железы путем нацеливания на PTEN и поддержания активации Akt/NF-κB/COX-2 (Li B. et al., 2017). Кроме того, настоящее исследование продемонстрировало, что введение экзогенного ADSC-Exo и трансфекция миметиков miR-221/222 могут активировать передачу сигналов AKT и снижать экспрессию NF-κB для обеспечения защиты.Таким образом, наши результаты показывают, что ADSC-Exo с миР-221/222 играет критическую роль в предотвращении сердечного I/R-индуцированного апоптоза и гипертрофии путем нацеливания на PUMA и ETS-1. Этот защитный эффект опосредуется через путь AKT/NFκB.

I/R повреждение миокарда приводит к апоптозу и гипертрофии. Мы демонстрируем, что экзосомы, секретируемые ADSC, играют положительную роль в облегчении травм I/R. Наши результаты показывают, что ADSC-Exo может уменьшить повреждение, вызванное I / R, через ось miR-221 / miR-222 / PUMA / ETS-1.Эти данные обеспечивают убедительные доказательства того, что ADSC-Exo имеет широкие перспективы для клинического применения при травмах I/R.

Заявление о доступности данных

Необработанные данные, подтверждающие выводы этой статьи, будут предоставлены авторами без неоправданных оговорок.

Заявление об этике

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Учебным комитетом по уходу и использованию животных Медицинского колледжа Национального Тайваньского университета (номер утверждения IACUC: 20150502).

Вклад авторов

T-CL, T-LL, Y-CCha и Y-CChe: концепция и дизайн, сбор и/или сбор данных, анализ и интерпретация данных и окончательное утверждение рукописи. S-RL, S-WL, C-MP и J-ST: предоставление учебного материала и окончательное утверждение рукописи. Y-LC: концепция и дизайн, финансовая поддержка, анализ и интерпретация данных, написание рукописи и окончательное утверждение рукописи. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Это исследование было поддержано исследовательским грантом Министерства науки и технологий Тайваня (MOST 105-2320-B-002-043-MY3).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы поблагодарили Shu-Mei Lai и Horng-Tzer Shy за техническую помощь в проведении эксперимента TEM.

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2020.569150/full#supplementary-material

Ссылки

Барраклаф, Дж. Ю., Джоан, М., Джоглекар, М. В., Хардикар, А. А., и Патель, С. (2019). МикроРНК как прогностические маркеры у пациентов с острым коронарным синдромом — систематический обзор. Ячейки 8:1572. doi: 10.3390/cells8121572

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Биспинг, Э., Вакула, П., Потесер, М., и Хайнцель, Ф.Р. (2014). Ориентация на сердечную гипертрофию: к причинной терапии сердечной недостаточности. Дж. Кардиовасц. Фармакол. 64, 293–305. DOI: 10.1097/fjc.00000000000000126

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Браун, Д. И., и Гриндлинг, К. К. (2015). Регуляция передачи сигнала активными формами кислорода в сердечно-сосудистой системе. Обр. Рез. 116, 531–549. doi: 10.1161/circresaha.116.303584

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чистяков Д.А., Собенин И.А., Орехов А.Н., Бобрышев Ю.В. (2015). МиР-221/222 человека при физиологическом и атеросклеротическом ремоделировании сосудов. Биомед. Рез. Междунар. 2015:354517. дои: 10.1155/2015/354517

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Corsten, M.F., Heggermont, W., Papageorgiou, A.P., Deckx, S., Tijsma, A., Verhesen, W., et al. (2015). Кластер микроРНК-221/-222 уравновешивает противовирусный и воспалительный ответ при вирусном миокардите. евро. Харт Дж. 36, 2909–2919. doi: 10.1093/eurheartj/ehv321

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Цуй, X., Хэ, З., Лян, З., Чен, З., Ван, Х., и Чжан, Дж. (2017). Экзосомы из мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани, защищают миокард от ишемии/реперфузии посредством сигнального пути Wnt/β-catenin. Дж. Кардиовасц. Фармакол. 70, 225–231. doi: 10.1097/fjc.0000000000000507

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Дхалла, Н.С., Эльмоселхи, А.Б., Хата, Т., и Макино, Н. (2000). Статус антиоксидантов миокарда при ишемически-реперфузионном повреждении. Кардиовасц. Рез. 47, 446–456. doi: 10.1016/s0008-6363(00)00078-x

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Дуань, М., Яо, Х., Ху, Г., Чен, X., Лунд, А. К., и Бух, С. (2013). Tat ВИЧ индуцирует экспрессию ICAM-1 в HUVEC: последствия для миР-221/-222 при ВИЧ-ассоциированной кардиомиопатии. PLoS One 8:e60170. doi: 10.1371/журнал.пон.0060170

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Эгучи С., Такефудзи М., Сакагути Т., Исихама С., Мори Ю., Цуда Т. и др. (2019). Кардиомиоциты захватывают полученную из стволовых клеток антиапоптотическую микроРНК-214 посредством клатрин-опосредованного эндоцитоза при остром инфаркте миокарда. Дж. Биол. хим. 294, 11665–11674. doi: 10.1074/jbc.RA119.007537

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хан Ю.Д., Бай Ю., Yan, X.L., Ren, J., Zeng, Q., Li, X.D., et al. (2018). Совместная трансплантация экзосом, полученных из предварительно кондиционированных гипоксией жировых мезенхимальных стволовых клеток, способствует неоваскуляризации и выживанию трансплантата при пересадке жира. Биохим. Биофиз. Рез. коммун. 497, 305–312. doi: 10.1016/j.bbrc.2018.02.076

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Харрелл, Ч.Р., Феллабаум, К., Йовичич, Н., Джонов, В., Арсениевич, Н., и Воларевич, В. (2019). Молекулярные механизмы, ответственные за терапевтический потенциал секретома, полученного из мезенхимальных стволовых клеток. Ячейки 8:467. doi: 10.3390/cells8050467

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Hawkins, N.M., Wang, D., Mcmurray, J.J., Pfeffer, M.A., Swedberg, K., Granger, C.B., et al. (2007). Распространенность и прогностические последствия электрокардиографической гипертрофии левого желудочка при сердечной недостаточности: данные программы CHARM. Сердце 93, 59–64. doi: 10.1136/hrt.2005.083949

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хойш, Г.и Герш, Б.Дж. (2017). Патофизиология острого инфаркта миокарда и стратегии защиты после реперфузии: постоянная проблема. евро. Heart J. 38, 774–784. doi: 10.1093/eurheartj/ehw224

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Heusch, G., Kleinbongard, P., and Skyschally, A. (2013). Инфаркт миокарда и коронарная микрососудистая обструкция: тесная, но сложная взаимосвязь. Базовое разрешение Кардиол. 108:380.doi: 10.1007/s00395-013-0380-y

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Hu, L., Wang, J., Zhou, X., Xiong, Z., Zhao, J., Yu, R., et al. (2016). Экзосомы, полученные из жировых мензенхимальных стволовых клеток человека, ускоряют заживление кожных ран за счет оптимизации характеристик фибробластов. науч. Реп. 6:32993. дои: 10.1038/srep32993

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Константинидис, К., Уилан, Р.С. и Китсис Р. Н. (2012). Механизмы гибели клеток при сердечно-сосудистых заболеваниях. Артериосклероз. тромб. Васк. биол. 32, 1552–1562. doi: 10.1161/atvbaha.111.224915

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Котхапалли Д., Кастаньино П., Радер Д. Дж., Филлипс М. К., Лунд-Кац С. и Ассоян Р. К. (2013). Опосредованная аполипопротеином Е остановка клеточного цикла связана с р27 и зависимой от ЦОГ2 репрессией миР221/222. Атеросклероз 227, 65–71.doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2012.12.003

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Lai, R.C., Arslan, F., Lee, M.M., Sze, N.S., Choo, A., Chen, T.S., et al. (2010). Экзосомы, секретируемые МСК, уменьшают ишемию/реперфузию миокарда. Рез. стволовых клеток. 4, 214–222. doi: 10.1016/j.scr.2009.12.003

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Li, B., Lu, Y., Yu, L., Han, X., Wang, H., Mao, J., et al. (2017).МиР-221/222 способствует свойствам раковых стволовых клеток и росту опухоли рака молочной железы посредством нацеливания на PTEN и устойчивой активации Akt/NF-κB/COX-2. Хим. биол. Взаимодействовать. 277, 33–42. doi: 10.1016/j.cbi.2017.08.014

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Li, Y., Liu, Y., Tian, ​​X., Zhang, Y., Song, H., Liu, M., et al. (2017). Клеточный репрессор E1A-стимулируемых генов является критическим фактором ремоделирования сосудов в ответ на ангиотензин II. Артериосклероз. тромб. Васк. биол. 37, 485–494. doi: 10.1161/atvbaha.116.308794

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ли, К., Цуй, С., Цзин, Г., Дин, Х., Ся, З. и Хэ, X. (2019). Роль сигнального пути PI3K/Akt в защитном действии пропофола на повреждение кишечника и легких, вызванное ишемией/реперфузией кишечника1. Acta Цирк. Бюстгальтеры. 34:e201

000005. doi: 10.1590/s0102-8650201

000005

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ли, Ю., Chen, B., Yang, X., Zhang, C., Jiao, Y., Li, P., et al. (2019). Передача сигналов S100a8/a9 вызывает митохондриальную дисфункцию и гибель кардиомиоцитов в ответ на ишемическое/реперфузионное повреждение. Тираж 140, 751–764. doi: 10.1161/circulationaha.118.039262

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Liang, C.J., Shen, W.C., Chang, F.B., Wu, V.C., Wang, S.H., Young, G.H., et al. (2015). Эндотелиальные клетки-предшественники, полученные из вартонова желе пуповины человека, ослабляют острое ишемическое повреждение почек за счет усиления васкуляризации и уменьшения апоптоза, воспаления и фиброза. клеточный транспл. 24, 1363–1377. дои: 10.3727/0914×681720

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лян, С.Дж., Ван, С.Х., Чен, Ю.Х., Чанг, С.С., Хванг, Т.Л., Леу, Ю.Л., и соавт. (2011). Висколин снижает экспрессию VCAM-1 в эндотелиальных клетках, обработанных TNF-α, посредством пути JNK/NF-κB и ROS. Свободный радикал. биол. Мед. 51, 1337–1346. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2011.06.023

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лин, К.C., Yip, H.K., Shao, P.L., Wu, S.C., Chen, K.H., Chen, Y.T., et al. (2016). Комбинация мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ADMSC), и экзосом, полученных из ADMSC, для защиты почек от острого ишемически-реперфузионного повреждения. Междунар. Дж. Кардиол. 216, 173–185. doi: 10.1016/j.ijcard.2016.04.061

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Луо Р., Чен С., Ма Х., Яо С., Лю М., Тао Дж. и др. (2019). Активация миокардиальной каспазы-3 и NF-κB способствует индуцированному калпаином септическому апоптозу: роль пути Akt/eNOS/NO. Науки о жизни. 222, 195–202. doi: 10.1016/j.lfs.2019.02.048

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ma, L., Liu, H., Xie, Z., Yang, S., Xu, W., Hou, J., et al. (2014). Гинзенозид Rb3 защищает кардиомиоциты от ишемически-реперфузионного повреждения посредством ингибирования JNK-опосредованного пути NF-κB: модель кардиомиоцитов мыши. PLoS One 9:e103628. doi: 10.1371/journal.pone.0103628

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мандл, А., Хыонг Фам, Л., Тот, К., Замбетти, Г., и Эрхардт, П. (2011). Делеция Puma задерживает сердечную дисфункцию в моделях сердечной недостаточности у мышей за счет ослабления апоптоза. Тираж 124, 31–39. doi: 10.1161/circulationaha.110.988303

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Pu, C.M., Liu, C.W., Liang, C.J., Yen, Y.H., Chen, S.H., Jiang-Shieh, Y.F., et al. (2017). Стволовые клетки, полученные из жировой ткани, защищают кожные лоскуты от ишемии/реперфузии посредством экспрессии IL-6. Дж. Инвест. Дерматол. 137, 1353–1362. doi: 10.1016/j.jid.2016.12.030

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Samidurai, A., Roh, S.K., Prakash, M., Durrant, D., Salloum, F.N., Kukreja, R.C., et al. (2019). Сигнальная ось STAT3-miR-17/20 играет критическую роль в ослаблении инфаркта миокарда после лечения рапамицином у мышей с диабетом. Кардиовасц. Рез. 116, 2103–2115. doi: 10.1093/cvr/cvz315

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Сантос-Гальего, К.Г., Вал Т.П., Голиаш Г., Пикатост Б., Ариас Т., Исикава К. и др. (2016). Агонист сфингозин-1-фосфатных рецепторов финголимод увеличивает спасение миокарда и снижает неблагоприятное постинфарктное ремоделирование левого желудочка в модели ишемии/реперфузии у свиней. Тираж 133, 954–966. doi: 10.1161/circulationaha.115.012427

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Шен, В. К., Лян, К. Дж., Ву, В. К., Ван, С. Х., Янг, Г. Х., Lai, I.R., et al. (2013). Эндотелиальные клетки-предшественники, полученные из вартонова желе пуповины, уменьшают вызванное ишемией повреждение задних конечностей у мышей с диабетом, индуцируя экспрессию HIF-1α/IL-8. Разработка стволовых клеток. 22, 1408–1418. doi: 10.1089/scd.2012.0445

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Сонг Дж., Оуян Ю., Че Дж., Ли X., Чжао Ю., Ян К. и др. (2017). Потенциальная ценность миР-221/222 в качестве диагностических, прогностических и терапевтических биомаркеров заболеваний. Перед. Иммунол. 8:56. doi: 10.3389/fimmu.2017.00056

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Тан, Б., Ли, X., Рен, Ю., Ван, Дж., Сюй, Д., Ханг, Ю., и др. (2017). МикроРНК-29a регулирует индуцированные липополисахаридами (ЛПС) воспалительные реакции в мышиных макрофагах посредством пути Akt1/NF-κB. Экспл. Сотовый рез. 360, 74–80. doi: 10.1016/j.yexcr.2017.08.013

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Тан, Б., Ма Дж., Ха X., Чжан Ю. и Син Ю. (2018). Фактор некроза опухоли-альфа активировал PHLPP1 посредством активации ядерного фактора-каппа B во время ишемии/реперфузии миокарда. Науки о жизни. 207, 355–363. doi: 10.1016/j.lfs.2018.06.023

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Toth, A., Jeffers, J.R., Nickson, P., Min, J.Y., Morgan, J.P., Zambetti, G.P., et al. (2006). Целенаправленное удаление Puma ослабляет гибель кардиомиоцитов и улучшает сердечную функцию во время ишемии-реперфузии. утра. Дж. Физиол. Цирк Сердца. Физиол. 291, H52–H60. doi: 10.1152/ajpheart.01046.2005

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Валенсия-Санчес, Массачусетс, Лю, Дж., Хэннон, Г.Дж., и Паркер, Р. (2006). Контроль трансляции и деградации мРНК с помощью miRNAs и siRNAs. Гены Дев. 20, 515–524. doi: 10.1101/gad.1399806

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Вержанс Р., Питерс Т., Бомонт Ф.J., Van Leeuwen, R., Van Herwaarden, T., Verhesen, W., et al. (2018). Семейство микроРНК-221/222 противодействует фиброзу миокарда при сердечной недостаточности, вызванной перегрузкой давлением. Гипертония 71, 280–288. doi: 10.1161/hypertensionaha.117.10094

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Wang, S.H., Lin, S.J., Chen, Y.H., Lin, F.Y., Shih, J.C., Wu, C.C., et al. (2009). Эндотелиальные клетки с поздним отростком, полученные из вартонского желе в пуповине человека, уменьшают образование неоинтимы после повреждения сосудов: участие фактора, происходящего из пигментного эпителия. Артериосклероз. тромб. Васк. биол. 29, 816–822. doi: 10.1161/atvbaha.109.184739

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ван, X., Тао, Ю., Хуан, Ю., Чжан, К., Сюэ, М., Ван, Ю., и др. (2017). Каталаза уменьшает повреждение сердца, вызванное диабетом, за счет снижения p65/RelA-опосредованной транскрипции BECN1. J. Cell Mol. Мед. 21, 3420–3434. doi: 10.1111/jcmm.13252

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ван, З., Hao, W., Hu, J., Mi, X., Han, Y., Ren, S., et al. (2019). Мальтол улучшает гепатотоксичность, вызванную APAP, путем ингибирования окислительного стресса и воспалительной реакции через сигнальные пути NF-κB и PI3K/Akt. Антиоксиданты 8:395. doi: 10.3390/antiox80

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Xiao, J., Pan, Y., Li, X.H., Yang, X.Y., Feng, Y.L., Tan, H.H., et al. (2016). Экзосомы, полученные из клеток-предшественников сердца, предотвращают апоптоз кардиомиоцитов посредством экзосомальной миР-21 путем нацеливания на PDCD4. Дис. клеточной смерти. 7:e2277. doi: 10.1038/cddis.2016.181

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Xu, L., Fu, M., Chen, D., Han, W., Ostrowski, M.C., Grossfeld, P., et al. (2019). Эндотелиально-специфическая делеция Ets-1 ослабляет индуцированный ангиотензином II сердечный фиброз посредством подавления эндотелиально-мезенхимального перехода. BMB Rep. 52, 595–600. doi: 10.5483/BMBRep.2019.52.10.206

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ян, Б., Lin, H., Xiao, J., Lu, Y., Luo, X., Li, B., et al. (2007). Специфичная для мышц микроРНК miR-1 регулирует сердечный аритмогенный потенциал путем нацеливания на GJA1 и KCNJ2. Нац. Мед. 13, 486–491. doi: 10.1038/nm1569

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ян, X., Фу, Дж., Ван, Х., Лю, З., Ю, Л., Ю, Б. и др. (2019). Защитная роль и механизмы таурина в отношении апоптоза, вызванного гипоксией/реоксигенацией миокарда. Акта Кардиол. Грех. 35, 415–424.doi: 10.6515/acs.201907_35(4).20181218a

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Yang, Y., Li, C., Xiang, X., Dai, Z., Chang, J., Zhang, M., et al. (2014). Урсоловая кислота предотвращает стресс-опосредованный апоптоз эндоплазматического ретикулума, вызванный тепловым стрессом в сердечных миоцитах мыши. Дж. Мол. Сотовый Кардиол. 67, 103–111. doi: 10.1016/j.yjmcc.2013.12.018

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Юань, X., Ню, Х. Т., Ван, П. Л., Lu, J., Zhao, H., Liu, S.H., et al. (2015). Кардиопротекторный эффект ликохалкона D против ишемии/реперфузии миокарда в сердцах крыс, перфузированных по Лангендорфу. PLoS One 10:e0128375. doi: 10.1371/journal.pone.0128375

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Zhan, Y., Brown, C., Maynard, E., Anshelevich, A., Ni, W., Ho, I.C., et al. (2005). Ets-1 является критическим регулятором опосредованного Ang II воспаления и ремоделирования сосудов. Дж.клин. Вкладывать деньги. 115, 2508–2516. дои: 10.1172/jci24403

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжан С., Чжан Дж., Чжан А., Ван Ю., Хань Л., Ю Ю. и др. (2010). PUMA является новой мишенью миР-221/222 при раке эпителия человека. Междунар. Дж. Онкол. 37, 1621–1626. дои: 10.3892/ijo_00000816

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Чжан, Х., Сян, М., Мэн, Д., Сунь, Н., и Чен, С. (2016). Ингибирование ишемии/реперфузии миокарда экзосомами, секретируемыми мезенхимальными стволовыми клетками. Стволовые клетки Int. 2016:4328362. дои: 10.1155/2016/4328362

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжан В., Лю Х., Цзян Ю., Ван Н., Ли Ф. и Синь Х. (2019). 6-гингерол ослабляет индуцированный ишемией-реперфузией апоптоз клеток в кардиомиоцитах AC16 человека посредством пути HMGB2-JNK1/2-NK-κB. Эвид. Дополнение на основе. Альтернативный. Мед. 2019:8798653. дои: 10.1155/2019/8798653

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжан, X., Shao, S., Geng, H., Yu, Y., Wang, C., Liu, Z., et al. (2014). Профили экспрессии шести циркулирующих микроРНК, критически важных для атеросклероза, у пациентов с субклиническим гипотиреозом: клиническое исследование. Дж. Клин. Эндокринол. Метаб. 99, Е766–Е774. doi: 10.1210/jc.2013-1629

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжао, Л., Ян, X. Р., и Хань, X. (2019). МикроРНК-146b индуцирует сигнальный путь PI3K/Akt/NF-κB для уменьшения воспаления сосудов и апоптоза при инфаркте миокарда путем нацеливания на PTEN. Экспл. тер. Мед. 17, 1171–1181. doi: 10.3892/etm.2018.7087

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжао, К. Д., Вишванадхапалли, С., Уильямс, П., Ши, К., Тан, К., Йи, X., и др. (2015). НАДФН-оксидаза 4 вызывает сердечный фиброз и гипертрофию посредством активации сигнальных путей Akt/mTOR и NFκB. Тираж 131, 643–655. doi: 10.1161/circulationaha.114.011079

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжао Ю., Ransom, J.F., Li, A., Vedantham, V., Von Drehle, M., Muth, A.N., et al. (2007). Нарушение регуляции кардиогенеза, сердечной проводимости и клеточного цикла у мышей, лишенных микроРНК-1-2. Сотовый 129, 303–317. doi: 10.1016/j.cell.2007.03.030

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжоу, Ю., Чен, К., Лью, К.С., Ричардс, А.М., и Ван, П. (2016). Открытие потенциальных терапевтических мишеней миРНК при ишемически-реперфузионном повреждении сердца. Дж. Кардиовасц.Фармакол. тер. 21, 296–309. дои: 10.1177/1074248415604463

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Zhu, N., Zhang, D., Chen, S., Liu, X., Lin, L., Huang, X., et al. (2011). Обогащенные эндотелием микроРНК регулируют вызванное ангиотензином II воспаление и миграцию эндотелия. Атеросклероз 215, 286–293. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2010.12.024

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

номеров дней на 2021 год

Нажмите здесь, чтобы узнать дни в 2022 году

На этой странице перечислены все дни в 2021 году с номерами дней и недель.
В 2021 году 365 дней.

« Номера дней на 2020 год | номера дней на 2022 год »

92% 9.32% 9.86% 9.44% (SAT) (ср.) 90,68% 97.26% 93,70%

Дата	Номер дня ber	Дней основной	Дней с сегодняшнего дня (пятница, 25-е)	неделя NUM BER	%	%
1 января	(FRI)	день 1	364	-448	неделя 53, 2020146	неделя 53, 2020146	0,00%
январь 2, 2021 (Сб)	День 2	363	-447	Неделя 53, 2020	0.27%
января 3, 2021 г. (Sun)	день 3	день 3	362	-446	-446	неделя 53, 2020146	неделя 53, 2020	0,55%
4 января, 2021 г. (понедельник)	день 4	361	-4445	неделя 1	неделя 1	0,82%
	день 5	360 9	360	-444 9	неделя 1	1,10%
, 2021 (ср)	День 6	359	-443	Неделя 1	1.37%
1 января 2021 г. (Thu)	день 7	день 7	358	358	-4442	неделя 1	1,64%
80147 (FRI)	день 8	357	-441	неделя 1	1	1,92%
	день 9	день 9	356	-4440	неделя 1	2,19%
10 января 2021 г. (Вс)	День 10	355	-439	Неделя 1	2.47%
1 января 11 января	день 11	день 11	3	— 438	-438	неделя 2	2,74%
12 января 2021 г. (TUE)	день 12	353	-437	-437	неделя 2	3	3.01%
13 января, 2021 г. (ср.)	день 13	352	-436	неделя 2	3,29%
1 января 2021 г. (Чт)	День 14	351	-435	Неделя 2	3.56%
15 января, 2021 г. (FRI)	день 15	день 15	350	-434	-434	неделя 2	3,84%
16 января 2021 (SAT)	день 16	349	-433	-433	неделя 2	недели 2	4.11%
1 января 2021 день (Sun)	день 17	348	-432	неделя 2	4,38%
1 января 2021 г. (Пн)	День 18	347	-431	Неделя 3	4.66%
19 января, 2021 г. (TUE)	день 19	день 19	3	-430	-430	неделя 3	4,93%
20 января 2021 г. (ср.)	день 20	345	-429	Неделя 3	Неделя 3	5,21%
21 января 21 января 9021 (Thu)	день 21	394	-428	неделя 3	5.48%
22 января 2021 г. (Пт)	День 22	343	-427	Неделя 3	5.75%
23 января, 2021 г. (SAT)	день 23	день 23	3	-426	неделя 3	6.03%
24 января 2021 г. (Sun)	день 24	341	-425	-425	Неделя 3	60146	60140	25 января, 2021 г. (пн)	день 25	340 9	-424	неделя 4	6.58%
26 января 2021 г. (Вт)	День 26	339	-423	Неделя 4	6.85%
27 января, 2021 г. (ср.)	день 27	379	-422 9	-422 9	неделя 4	7.12%
28 января 2021 (Thu)	день 28	337	-421	-421	неделя 4	70146	70140
29 января 2021 г. (FRI)	день 29	399	-420	неделя 4	7,67%
30 января 3021 г. (Сб)	День 30	335	-419	Неделя 4	7.95%
31 января
31 января 9021 г. (Солнце)	день 31	314	-418	-418	неделя 4	8.22%
1 февраля, 2021 г. (Мон)	день 32	32	3233	-417	-417	неделя 5	80146	80140
29 февраля	день 33	332	-416	неделя 5	80140
3 февраля 2021 г. (Среда)	День 34	331	-415	Неделя 5	9.04%
4 февраля, 2021 г. (Thu)	день 35	330	330	-414	неделя 5	9,32%
5 февраля, 2021 г. (FRI)	день 36	329	-413	-413	неделя 5	неделя 5	9.59%
60147
	день 37	399	-412	неделя 5	9,86%
7 февраля (Вс)	День 38	327	-411	Неделя 5	10.14%
80140
	день 39	день 39	326	-410	неделя 6	10.41%
	день (Tue)	день 40	325	-409	неделя 6	неделя 6	10,68%
100147
10 февраля	день 41	день 41	324	-408	неделя 6	10.96%
февраля 11 февраля (Чт)	День 42	323	-407	Неделя 6	11.23%
12 февраля, 2021 г. (FRI)	день 43	день 43	322	-406	неделя 6	11.51%
день 44	321	-405	неделя 6	неделе 6	11.78%
14 февраля 2021 г. (Sun)	день 45	320	-404	неделя 6	12.05%
15 февраля 2021 г. (Пн)	День 46	319	-403	Неделя 7	12.33%
16 февраля, 2021 г. (Вт)	день 47	318	-402	-402	неделе 7	12.60%
17 февраля 2021 (ср.)	день 48	317	-401	неделя 7	неделе 7	12,88%
	день (Thu)	день 49	316	-400	неделя 7	13.15%
19 февраля 19, 2021 гг. (Пт)	День 50	315	-399	Неделя 7	13.42%
20 февраля 2021 года (SAT)	день 51	день 51	314	-398	-398	неделя 7	13,70%
21 февраля 2021 г. (Sun)	день 52	313	-397	-397	неделя 7	неделя 7	13.97%
22 февраля, 2021 г. (пн)	день 53	312	-396	неделя 8	14,25%
23 февраля (Вт)	День 54	311	-395	Неделя 8	14.52%
24 февраля 2021 (ср.)	день 55	310	-394	-394	неделя 8	14,79%
25 февраля, 2021 г. (Thu)	день 56	309	-393	неделя 8	неделе 8	15.07%
26 февраля, 2021 г. (FRI)	день 57	день 57	308	-392	неделя 8	15,34%
27 февраля 2021 г. (Сб)	День 58	307	-391	Неделя 8	15.62%
28 февраля, 2021 г. (Солнце)	день 59	день 59	306	-390	-390	неделя 8	15.89%
1 марта, 2021 г. (Мон)	день 60146	305	-389	неделя 9	неделя 9	16.16%
2 марта 2021 (Вт)	день 61	304	-388	неделя 9	16.44%
3 марта 2021 (Среда)	День 62	303	-387	Неделя 9	16.71%
4 марта
	день 63	день 63	302	-386	-386	неделя 9	16,99%
день 64	301	-385	неделя 9	неделя 9	17,26%
60141
марта	день 65	день 65	300	-384	неделя 9	17,53%
70 марта 2021 г. (Вс)	День 66	299	-383	Неделя 9	17.81%
марта 8, 2021 г. (пн)	день 67	день 67	298	-382	-382	неделя 10	18.08%
9, 2021 г. (Tue)	день 68	297	-381	неделя 10	неделя 10	18,36%
10 марта, 2021 г. (ср.)	день 69	день 69	296	-380	неделя 10	18,63%
г. 11 марта, 2021 г. (Чт)	День 70	295	-379	Неделя 10	18.90%
12 марта, 2021 г. (FRI)	день 71	день 71	294	-378	-378	неделя 10	19,18%
13 марта, 2021 (SAT)	день 72	293	-377	-377	неделя 10	19,45%
14 марта 2021 г. (Sun)		день 73	Day 73	292	-376	неделя 10	19,73%
15 марта 2021 г. (Пн)	День 74	291	-375	Неделя 11	20.00%
16 марта, 2021 г. (вт)	день 75	290	290	-374	-374	неделя 11	20,27%
17 марта 2021 (ср.)	день 76	289	-373	неделя 11	неделя 11	20.55%
18 марта 2021 г. (Thu)	день 77	288	-372	-372	неделя 11	20,82%
9, 2021 (пт)	День 78	287	-371	Неделя 11	21.10%
20 марта 2021 г. (SAT)	день 79	день 79	286	-370	неделя 11	неделя 11	21,37%
21 марта 21 марта 2010 г. (Sun)	день 80	285	-369	неделя 11	неделя 11	21,64%
22 марта 2021 г. (пн)	день 81	284	-368	неделя 12	21.92%
23 марта, 2021 г. (Вт)	День 82	283	-367	Неделя 12	22.19%
24 марта 2021 г. (ср.)	день 83	день 83	282	-366	-366	неделя 12	22,47%
25 марта 2021 (Thu)	день 84	281	-365	неделя 12	неделя 12	22.74%
26 марта 2021 г. (FRI)	день 85	280	-364	неделя 12	23.01%
27 марта 2021 (Сб)	День 86	279	-363	Неделя 12	23.29%
28 марта, 2021 г. (Sun)	день 87	день 87	278	-362	-362	неделя 12	23.56%
29 марта, 2021 г. (МОН)	день 88	277	-361	неделя 13	неделя 13	23,84%
30 марта, 2021 г. (вт)	день 89	276	-360	неделя 13	24.11%
31 марта 2021 г. (Среда)	День 90	275	-359	Неделя 13	24.38%
1 апреля
апреля	день 91	день 91	274	-358	-358	неделя 13	24,66%
2 апреля 2021 (FRI)	день 92	273	-357	неделя 13	неделя 13	24,93%
день 93	272 93	272	-356	Неделя 13	25,21%
4 апреля 2021 г. (Вс)	День 94	271	-355	Неделя 13	25.48%
апреля 50140	апреля	день 95	день 95	270	— 354	-354	неделя 14	25.75%
6 апреля 2021 г. (TUE)	день 96	269	-353	-353	неделя 14	неделе 14	26.03%
70141 день 97	день 97	268	-352	неделя 14	26.30%
8 апреля 2021 г. (Чт)	День 98	267	-351	Неделя 14	26.58%
9 апреля
9 апреля	день 99	день 99	266	-350	-350	неделя 14	26,85%
10 апреля 2021 (SAT)	день 100	265	-349	-349	неделя 14	27.12%
апреля	день 101	день 101	264	-348	неделя 14	27,40%
12 апреля 2021 г. (Пн)	День 102	263	-347	Неделя 15	27.67%
13 апреля, 2021 г. (вт)	день 103	день 103	262	— 346	-346	неделя 15	27.95%
14 апреля 2021 (ср.)	день 104	261	-345	-345	неделя 15	неделя 15	28,22%
15 апреля 2021 г. (Thu)	день 105	260	-344	неделя 15	28,49%
16 апреля 2021 г. (пт)	День 106	259	-343	Неделя 15	28.77%
17 апреля 2021 г. (SAT)	день 107	день 107	258	-342	-342	неделя 15	29.04%
18 апреля 2021 (Солнце)	день 108	257	-341	-341	Неделя 15	Неделя 15	29,32%
	день 109	день 109	256	-340	Неделя 16	29,59%
20 апреля 2021 г. (Вт)	День 110	255	-339	Неделя 16	29.86%
21 апреля, 2021 г. (ср.)	день 111	день 111	254	-334	-3338	неделя 16	30.14%
22 апреля 2021 (Thu)	день 112	253	-337	неделя 16	неделя 16	30.41%
23 апреля 2021 г. (FRI)	день 113	252	-336	неделя 16	30,68%
24 апреля 2021 г. (Сб)	День 114	251	-335	Неделя 16	30.96%
25 апреля, 2021 г. (Солнце)	день 115	день 115	250	-334	-334 9	неделя 16	31,23%
26 апреля 2021 (Mon)	день 116	249	-333	неделя 17	неделя 17	31.51%
	день 117	день 117	248	-332	неделя 17	31,78%
28 апреля, 2021 г. (Среда)	День 118	247	-331	Неделя 17	32.05%
29 апреля 2021 г. (Thu)	день 119	день 119	246	-330	неделя 17	неделя 17	32,33%
30 апреля 2021 (FRI)	день 120	245	-329	Неделя 17	неделя 17	32.60%
день 121	день 121	244	-328	неделя 17	32,88%
2 мая 2, 2021 (Вс)	День 122	243	-327	Неделя 17	33.15%
3 мая 2021 г. (пн)	день 123	день 123	242 9	-326	неделя 18	33.42%
4 мая 2021 г. (TUE)	день 124	241	-325	-325	неделя 18	неделя 18	33.70%
5 мая 2021 г. (ср.)	день 125	240	-324	неделя 18	33,97%
6 мая 2021 (Чт)	День 126	239	-323	Неделя 18	34.25%
мая 7, 2021 г. (пт)	день 127	день 127	238	-322	неделя 18	3452%
мая 8, 2021 (SAT)	день 128	237	-321	-321	неделя 18	неделя 18	34.79%
9 мая 2021 г. (Солнце)	день 129	236	-320	Неделя 18	35.07%
10 мая 2021 (Пн)	День 130	235	-319	Неделя 19	35.34%
11 мая 2021 г. (TUE)	день 131	день 131	234	-318	-318	неделя 19	35.62%
12 мая 2021 (ср)	день 132	233	-317	-317	Неделя 19	35,89%
13 мая 2021 г. (Thu)	день 133	232	-316	неделя 19	36,16%
мая 14, 2021 (Пт)	День 134	231	-315	Неделя 19	36.44%
15 мая 2021 (SAT)	день 135	день 135	230	-314	неделя 19	неделя 19	36,71%
9 мая 2021 г. (Sun)	день 136	229	-3146	-313	неделя 19	36.99%
9 мая 2021 г. (пн)	день 137	228	— 312	неделя 20	37,26%
Магию 18, 2021 г. (Вт)	День 138	227	-311	Неделя 20	37.53%
мая 19, 2021 (ср)	день 139	день 139	226	-310	неделя 20	37.81%
мая 20, 2021 г. (Thu)	день 140	225	-309	Неделя 20	неделя 20	38.08%
21 мая 2021 (FRI)	день 141	224	-308	неделя 20	38,36%
22 мая 2021 (Сб)	День 142	223	-307	Неделя 20	38.63%
23 мая 2021 (Солнце)	день 143	222	— 306	-306	неделя 20	38,90%
магии 24, 2021 (понция)	день 144	221	-305	неделя 21	неделя 21	39,18%
25 мая 2021 г. (TUE)	день 145	220	-304	неделя 21	39,45%
мая 26, 2021 гг. (Среда)	День 146	219	-303	Неделя 21	39.73%
27 мая, 2021 (Thu)	день 147	день 147	218	-302	-302	неделя 21	40,00%
28 мая 2021 г. (FRI)	день 148	217	-301	неделя 21	неделя 21	40,27%
мая	день 149	день 149	216	-300	неделя 21	40,55%
30 мая 3021 (Вс)	День 150	215	-299	Неделя 21	40.82%
31 мая, 2021 г. (пн)	день 151	день 151	214	-298	-298	неделя 22	41.10%
1 июня 2021 г. (TUE)	день 152	213	-297	неделя 22	неделя 22	41.37%
2 июня 2021 г. (ср.)	день 153	212	-296	неделя 22	41,64%
3 июня 2021 г. (Чт)	День 154	211	-295	Неделя 22	41.92%
4 июня, 2021 г. (FRI)	день 155	день 155	210	-294 9	-294 9	неделя 22	42.19%
5 июня 2021 (SAT)	день 156	209	-293	неделя 22	неделя 22	42,47%
60141 день (Sun)	день 157	день 157	208	-292	неделя 22	42,74%
7 июня 2021 г. (Пн)	День 158	207	-291	Неделя 23	43.01%
80146	день 159	день 159	206	-290	-290	неделя 23	43.29%
9, 2021 г. (ср.)	день 160	205	-289	неделя 23	неделя 23	43.56%
	день 161	день 161	204	-288	неделя 23	43,84%
11 июня, 2021 г. (Пт)	День 162	203	-287	Неделя 23	44.11%
12 июня, 2021 г. (SAT)	день 163	день 163	202	-286	-2-286	неделя 23	44.38%
13 июня, 2021 г. (Sun)	день 164		-285	неделя 23	неделя 23	44,66%
14 июня, 2021 г. (пн)	день 165	200	-284	Неделя 24	44,93%
15 июня 2021 г. (Вт)	День 166	199	-283	Неделя 24	45.21%
16 июня 2021 г. (ср.)	день 167	день 167	— 28	-282	неделя 24	45,48%
17 июня, 2021 г. (Thu)	день 168	197	-281	-281	неделя 24	45.75%
18 июня, 2021 г. (FRI)	день 169	день 169 99	196	-280	неделя 24	46.03%
июнь 19, 2021 г. (Сб)	День 170	195	-279	Неделя 24	46.30%
20 июня 2021 г. (Sun)	день 171	день 171	194 9 9 9	-278	неделя 24	46,58%
21 июня, 2021 г. (Пн)	день 172	день 173	-277	-277	Неделя 25	60146	46.85%
22 июня 2021 г. (Вт)	День 173	192	-276	Неделя 25	47,12%
23 июня, 2021 г. (Среда)	День 174	191	-275	Неделя 25	47.40%
24 июня, 2021 г. (Thu)	день 175	день 175	190	-274	-274	неделя 25	47.67%
25 июня, 2021 г. (FRI)	день 176		-273	неделя 25	неделя 25	47.95%
26 июня, 2021 г. (SAT)	день 177	день 177	188	-2-272	неделя 25	48,22%
27 июня 2021 г. (Вс)	День 178	187	-271	Неделя 25	48.49%
28 июня
	день 179	день 179	186	-270	неделя 26	неделя 26	48,77%
29 июня 2021 г. (TUE)	день 180	185	-269	неделя 26	неделя 26	49.04%
	день 181	день 181	184	-268	неделя 26	49,32%
1 июля 1, 2021 гг. (Чт)	День 182	183	-267	Неделя 26	49.59%
2 июля
2 июля	день (FRI)	день 183	день 183	-266	-266	неделя 26	49,86%
3 июля 2021 (SAT)	день 184	181	-265	неделя 26	неделя 26	50.14%
4 июля 2021 г. (Солнце)	день 185	180	-264	неделя 26	50,41%
июль 5, 2021 г. (Пн)	День 186	179	-263	Неделя 27	50.68%
6 июля, 2021 г. (вт)	день 187	день 187	178	-262	неделя 27	50,96%
70147
день 188	день 187	-261	неделя 27	неделя 27	51.23%
8, 2021 г. (Thu)	день 189	день 189	176	-260	неделя 27	51.51%
9 июля 9, 2021 гг. (Пт)	День 190	175	-259	Неделя 27	51.78%
10 июля, 2021 г. (SAT)	день 191	день 191	174	-258	-258	неделя 27	52.05%
11 июля 2021 г. (Солнце)	день 192	173	-257	-257	неделя 27	неделя 27	52,33%
12 июля 2021 г. (пн)	день 193	172	-2156	неделя 28	52,60%
13 июля, 2021 г. (Вт)	День 194	171	-255	Неделя 28	52.88%
14 июля, 2021 г. (ср.)	день 195	день 195	170	-254	неделя 28	53.15%
15 июля 2021 (Thu)	день 196 99	169 99	-253	-253	неделя 28	неделя 28	53.42%
16 июля 2021 г. (FRI)	день 197	день 197	-252	неделя 28	53,70%
г. 17 июля 2021 г. (Сб)	День 198	167	-251	Неделя 28	53.97%
18 июля, 2021 г. (Sun)	день 199146	день 199	166	-250	-250	неделя 28	54.25%
	(Mon)	день 200	165	-249	-2149	неделя 29	неделя 29	54.52%
20 июля 2021 (Вт)	день 2010146	164	-248	неделя 29	54,79%
21 июля 2021 (Среда)	День 202	163	-247	Неделя 29	55.07%
22 июля, 2021 г. (Thu)	день 203	день 203	162	-246	неделя 29	55,34%
23 июля 2321 (FRI)	день 204	161	-245	-245	Неделя 29	55.62%
День 205	День 205	160	-244	Неделя 29	55,89%
25 июля 2021 г. (Вс)	День 206	159	-243	Неделя 29	56.16%
26 июля 20210	26 июля 2021 г. (пн)	день 207	день 207	158	-242	неделя 30	56,44%
27 июля, 2021 г. (Tue)	день 208		-241	-241	неделя 30	56,7146	56.71%
28 июля 2021 (Ср)	день 209	156	-240	неделя 30	56.99%
29 июля 2921 (Чт)	День 210	155	-239	Неделя 30	57.26%
30, 202140	30 июля, 2021 г. (FRI)	день 211	день 211	154	-238	неделя 30	неделя 30	57.53%
31 июля, 2021 (SAT)	день 212	153	-237	-237	неделя 30	57,8146	57,81%
1 августа 2021 г. (Sun)	день 213	день 213	152	-236	Неделя 30	58,08%
августа 2, 2021 (Пн)	День 214	151	-235	Неделя 31	58.36%
августа 3, 2021 г. (TUE)	день 215	день 215	150	-234	— 234	неделя 31	58,63%
4 августа 2021 (ср.)	день 216	149	-233	-233	неделя 31	58.90%
	день 217	день 217	148	-232	неделя 31	59,18%
6 августа 2021 г. (Пт)	День 218	147	-231	Неделя 31	59.45%
70140	августа 7, 2021 г. (SAT)	день 219	день 219	146	-230	неделя 31	неделя 31	59.73%
августа 8, 2021 (Sun)	день 220	145	-229	неделя 31	неделя 31	60140
августа	день 221	день 221	144	-228	неделя 32	60,27%
августа 10 августа 2021 года (Вт)	День 222	143	-227	Неделя 32	60.55%
11 августа, 2021 г. (ср.)	день 223	день 223	142	-226	неделя 32	60,82%	60,82%
12 августа 2021 (Thu)	день 224	141	-225	неделя 32	неделя 32	61.10%
13 августа 2021 (пт)	день 225	140	-224	неделя 32	61.37%
14 августа 2021 г. (Сб)	День 226	139	-223	Неделя 32	61.64%
15 августа, 2021 г. (Sun)	день 227	138	138	-2222 9	неделя 32	61.92%
День 228	137	-221	-221	неделя 33	62.19%
17 августа 2021 г. (вт)	день 229	136	-220	неделя 33	62,47%
18 августа, 2021 г. (Среда)	День 230	135	-219	Неделя 33	62.74%
августа 19, 2021 г. (thu)	день 231	день 231	134	-218	-2118	неделя 33	63.01%
августа 20, 2021 (FRI)	день 232	133	-217	неделя 30146	неделя 33	63.29%
21 августа, 2021 г. (SAT)	день 233	день 233	132	-2116	неделя 33	63.56%
22 августа 2021 (Вс)	День 234	131	-215	Неделя 33	63.84%
23 августа, 20210		день 235	день 235	130	-214	-21414	неделя 34	64.11%
24 августа 2021 г. (Tue)	день 236	129	-213	-213	неделя 34	64.38%
25 августа 2021 (ср.)	день 237	128	-212	неделя 34	64,66%
26 августа 2021 года (Чт)	День 238	127	-211	Неделя 34	64.93%
27 августа, 2021 г. (FRI)	день 239	день 239	126	-210	неделя 34	65,21%
28 августа 2021 (SAT)	день 240	125	-209	неделя 34	неделя 34	65,48%
29 августа 2021 г. (Sun)	день 241	день 241	124	-208	неделя 34	65,75%
30 августа 3021 г. (Пн)	День 242	123	-207	Неделя 35	66.03%
31 августа
августа 31 августа, 2021 г. (вт)	день 243	122	-206	-206 9	неделя 35	66.30%
день 244	121	-205	неделя 39	неделя 35	66.58%
	день (Thu)	день 245	120	-204	неделя 35	66,85%
3 сентября 2021 г. (Пт)	День 246	119	-203	Неделя 35	67.12%
	день (SAT)	день 247	день 247	118	-202	неделя 35	67.40%	67.40%
5 сентября 2021 г. (Солнце)	день 248	117	-201	неделя 35	неделя 35	67.67%
60147
день 249	день 249	116	-200	неделя 36	67.95%
7 сентября 2021 г. (Вт)	День 250	115	-199	Неделя 36	68.22%
	день 251	день 251	114	-198	-198	неделя 36	68.49%
	(Thu)	день 252	113	-197	-197	неделя 36	68.77%
	день 253	день 253	112	-196	неделя 36	69,04%
11 сентября 2021 г. (Сб)	День 254	111	-195	Неделя 36	69.32%
120140	(Sun)	день 255	день 255	110	-194	-194	неделя 36	69.59%
	(Mon)	день 256	109	-193	-193	неделя 37	69,86%
14 сентября 2021 г. (TUE)	день 257	108	-192	неделя 37	70,14%
15 сентября 2021 г. (Среда)	День 258	107	-191	Неделя 37	70.41%
160140	16 сентября 2021 (Thu)	день 259	день 259	-190	-190	неделя 37	70,68%
день 260	105	-189	-189	Неделя 37	7096%
день 261	день 261	104	-188	неделя 37	71,23%
	(Вс)	День 262	103	-187	Неделя 37	71.51%
20 сентября 2021 г. (пн)	день 263	день 263	102	-186	неделя 38	71,78%
21 сентября 2021 г. (TUE)	день 264	101	-185	неделя 38	72.0546	72.05%
день 265	день 265	100	-184	неделя 38	72,33%
23 сентября 2021 г. (Чт)	День 266	99	-183	Неделя 38	72.60%
24 сентября, 2021 г. (FRI)	день 267	98	98	-182	неделя 38	72,88%	72,88%
25 сентября 2021 (SAT)	день 268	97	-181	-181	неделя 38	73.15%
26 сентября 2021 г. (Sun)	день 269	день 269	96	-180	неделя 38	73,42%
27 сентября 2021 г. (Пн)	День 270	95	-179	Неделя 39	73.70%
	день 271	день 271	94	-178	-178	неделя 39	73,97%
29 сентября 2021 г. (ср.)	День 272	93	-177	-177	неделя 39	74.25%
	день 273	день 273	92	-176	неделя 39	74,52%
1 октября (Пт)	День 274	91	-175	Неделя 39	74.79%
2 октября, 2021 г. (SAT)	день 275	день 275	90	-174	-174	неделя 39	75.07%	75,07%
9 октября 2021 г. (Солнце)	день 276	89	-173	неделя 39	75,34%
	день 277	день 277	88	-172	неделе 40	75.62%
5 октября 2021 г. (Вт)	День 278	87	-171	Неделя 40	75.89%
6 октября, 2021 г. (ср.)	день 279	день 279	86	-170	неделя 40	76,16%
9, 2021 (Thu)	день 280	85	-169	неделя 40	неделя 40	76.44%
9, 2021 г. (FRI)		день 281	день 281	84	-168	неделя 40	76,71%
9 октября 2021 г. (Сб)	День 282	83	-167	Неделя 40	76.99%
10 октября, 2021 г. (Sun)	день 283	день 283	82	-166	неделя 40	77.26%
11 октября, 2021 г. (Mon)	день 284	81	-165	неделя 41	77.53%
12 октября 2021 г. (Вт)	день 285	80146	-164	неделя 41	неделя 41	77,81%
13 октября 2021 г. (Среда)	День 286	79	-163	Неделя 41	78.08%
14 октября, 2021 г. (Thu)	день 287	день 287	78	-162	неделя 41	неделя 41	78,36%
15 октября 2021 (FRI)	день 288	77	-161	неделя 41	78.63%
16 октября 2021 (SAT)	день 289	день 289	76	-160	неделя 41	78,90%
17 октября 2021 г. (Вс)	День 290	75	-159	Неделя 41	79.18%
18 октября, 2021 г. (Mon)	день 291	день 291	74	-158	неделя 42	неделя 42	7945%
	(TUE)	день 292	73	-157	неделя 42	79.73%
20 октября 2021 г. (ср.)	день 293	день 293	72	-156	неделя 42	80,00%
21 октября 2021 г. (Чт)	День 294	71	-155	Неделя 42	80.27%
22 октября, 2021 г. (пт)	день 295	день 295	70	-154	-154	неделя 42	80,55%
23 октября, 2021 (SAT)	день 296	69	-153	неделя 42	80,82%
24 октября 2021 г. (Sun)	день 297	день 297	68	-152	неделя 42	81.10%
25 октября 2021 г. (Пн)	День 298	67	-151	Неделя 43	81.37%
26 октября, 2021 г. (TUE)	день 299	день 299	-150	-150	неделя 43	81,64%
27 октября, 2021 (ср.)	день 300	65	-149	-149	неделя 43	81.92%
28 октября 2021 (Thu)	день 301	день 301	64	-148	неделя 43	82.19%
29 октября 2021 г. (Пт)	День 302	63	-147	Неделя 43	82.47%
30 октября, 2021 г. (SAT)	день 303	день 303	62	-146	неделя 43	82,74%	82,74%
31 октября, 2021 г. (Sun)	день 304	61	-145	-145	неделя 43	83.0146	83.01%
1 ноября 2021 г. (пн)	день 305	60146	-144	неделя 44	83,29%	83,29%
Ноябрь 2, 2021 г. (Вт)	День 306	59	-143	Неделя 44	83.56%
Ноябрь 3, 2021 г. (ср.)	день 307	день 307	58	-142	неделя 44	83,84%
4 ноября 2021 (Thu)	день 308	57	-141	-141	неделя 44	84.11%
день 309	день 309	56	-140	неделя 44	84,38%
6 ноября 2021 г. (Сб)	День 310	55	-139	Неделя 44	84.66%
17 ноября 2021 г. (Солнце)	день 311	день 311	-138	-138	неделя 44	84,93%
80147
день 312	53	-137	неделя 45	неделя 45	85.21%
	день 313	день 313	52	-136	неделя 45	85,48%
10 ноября 2021 г. (Среда)	День 314	51	-135	Неделя 45	85.75%
11 ноября, 2021 г. (Thu)	день 315	день 315	50	-134	-134 9	неделя 45	86,03%
12 ноября 2021 (FRI)	день 316	49	-133	недели 45	86.30%
день 317	день 317	48	-132	неделя 45	86,58%
14 ноября 2021 г. (Вс)	День 318	47	-131	Неделя 45	86.85%
15 ноября 2021 г. (Mon)	день 319	день 319	-130	-130	неделя 46	87.12%
16 ноября 2021 г. (TUE)	день 320	45	-129	недели 46	87.40%
17 ноября 2021 г. (ср.)	день 321	день 321	44	-128	неделя 46	87,67%
ноября 18, 2021 гг. (Чт)	День 322	43	-127	Неделя 46	87.95%
19 ноября, 2021 г. (пт)	день 323	день 323	—126	-126	неделе 46	88,22%
20 ноября 2021 (SAT)	день 324	41	-125	неделя 46	неделя 46	88.49%
21 ноября 2021 г. (Sun)	день 325	день 325	40	-124	неделя 46	88,77%
22 ноября, 2021 г. (Пн)	День 326	39	-123	Неделя 47	89.04%
23.10140	23 ноября, 2021 г. (TUE)	день 327	день 327	-122	-122	неделя 47	89,32%
24 ноября 2021 г. (ср.)	день 328	37	37	-121	неделя 47	89,59%
25 ноября, 2021 г. (Thu)	день 329	36	-120	неделя 47	89,86%
26 ноября 26, 2021 (Пт)	День 330	35	-119	Неделя 47	90.14%
27 ноября, 2021 г. (SAT)	день 331	день 331	331	-118	неделя 47	9041%
28 ноября, 2021 г. (Солнце)	день 332	33	-117	неделя 47	90,68%
29 ноября, 2021 г. (Mon)	день 333	день 333	32	-116	неделя 48	9096%
30 ноября 3021 г. (Вт)	День 334	31	-115	Неделя 48	91.23%
1 декабря, 2021 г. (ср.)	день 335	день 335	30	-114	неделя 48	91,5140146	91,5140
2 декабря 2021 (Thu)	день 336	29	-113	Неделя 49	неделя 48	91,78%
	день (FRI)	день 337	день 337	28	-112	неделя 48	92,05%
4 декабря 2021 (Сб)	День 338	27	-111	Неделя 48	92.33%
5 декабря 2021 г. (Sun)	день 339	день 339	26	-110	неделя 48	92,60%	92.60%
6 декабря 2021 (Mon)	день 340146	25	-109	неделя 49	92,88%
день 341	день 341	24	-108	неделя 49	93,15%
(Среда)	День 342	23	-107	Неделя 49	93.42%
9 декабря 2021 (Thu)	день 343	день 343	22	-106	неделя 49	93,70%
10 декабря 2021 (FRI)	день 344	21	-105	неделя 49	93.97%
день 345	день 345	20	-104	неделя 49	94,25%
12 декабря 2021 (Вс)	День 346	19	-103	Неделя 49	94.52%
13 декабря 2021 г. (Mon)	день 347	день 347	18	-102	неделя 50	неделя 50	94,79%
14 декабря 2021 г. (TUE)	день 348		-101	неделя 50	неделя 50	95.07%
15 декабря 2021 (ср.)	день 349	16	-100	неделя 50	95,34%
16 декабря 2021 (Чт)	День 350	15	-99	Неделя 50	95.62%
17 декабря 2021 г. (FRI)	день 351	день 351	14	-98	неделю 50	неделя 50	95,89%
18 декабря 2021 (SAT)	день 352	13	-97	неделя 50	неделя 50	96,16%
декабря	день 353	день 353	12	-96	неделя 50	96,44%
20 декабря 2021 (Пн)	День 354	11	-95	Неделя 51	96.71%
21 декабря 21 декабря, 2021 г. (вт)	день 355	день 355	10	-94	неделя 51	96,9	96,99%
22 декабря 2021 (ср.)	День 356	9	-93	неделя 51	97.26%
23 декабря 2021 г. (Thu)	день 357	Day 357	8	-92 9	неделя 51	97.53%
24 декабря 2021 (пт)	День 358	7	-91	Неделя 51	97.81%
25 декабря, 2021 г. (SAT)	день 359	день 359	6	-90	неделя 51	неделя 51	98.08%
26 декабря 2021 (Sun)	день 360146	5	-89	неделя 51	98,36%
27 декабря 2021 г. (пн)	день 361	день 361	4	-88	неделя 52	98,63%
28 декабря, 2021 г. (Вт)	День 362	3	-87	Неделя 52	98.90%
29 декабря 2021 (ср.)	день 363	день 363	2	-86	неделя 52	99,18%	99,18%
30 декабря 2021 (Thu)	день 364	1	-85	неделя 52	99 4	99.45%
31 декабря 2021 г. (FRI)	день 365	день 365	0	-84	неделя 52	99,73%

« Номера дней на 2020 год | номера дней на 2022 год »

Другие годы: 1920-1989 | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 | 2012 | 2013 | 2014 | 2015 | 2016 | 2017 | 2018 | 2019 | 2020 | 2021 | 2022 | 2023 | 2024 | 2025 | 2026 | 2027 | 2028 | 2029 | 2030 | 2031 | 2032 | 2033 | 2034 | 2035 | 2036 | 2037 | 2038 | 2039 | 2040

См. также : Номера недель на 2021 год

OL-220, OL-221, OL-222, OL-223, OL-224, OL-225 или OL-226 при использовании онлайн-служб

Обзор

Чтобы сделать возможной загрузку транзакций в Quicken, финансовые учреждения создают файлы Quicken в специальном формате.Иногда эти файлы изменяются таким образом, что их нельзя загрузить в Quicken.

Прежде чем начать

• При получении этих ошибок мы рекомендуем сначала проверить Сообщество Quicken на наличие предупреждений о широко распространенных проблемах или сбоях в работе банка.
• Возможно, вы сможете успешно войти на веб-сайт своего банка, но по-прежнему будете получать сообщение об ошибке в Quicken из-за проблемы с файлом, отправляемым банком.
• VPN может вызвать появление этой ошибки при использовании Quicken.Отключение VPN обычно решает проблему.
• Вы можете выполнить следующие шаги, чтобы попытаться обновить соединение; это гарантирует, что вы сможете получить последний файл от вашего финансового учреждения. Однако в конечном итоге это может потребоваться решить вашему банку.
• Если вы получаете одну из этих ошибок при попытке добавить учетную запись в Quicken в первый раз, это может означать, что банк требует от вас авторизации для предоставления доступа к Quicken. Попробуйте войти на веб-сайт банка и найти подсказки для подтверждения.Для авторизации доступа может потребоваться обращение в банк.

Найдите финансовое учреждение, вызвавшее ошибку

1. Откройте Tools > One Step Update Summary , чтобы найти банк, в котором представлена ​​эта ошибка OL. Кроме того, проверьте точный код ошибки, который вы получаете, чтобы подтвердить, что это одна из описанных здесь ошибок.
2. Откройте реестр для этого банковского счета.
3. Щелкните Действия с учетной записью (кнопка или значок шестеренки) в правом верхнем углу реестра.

4. Выберите Обновить сейчас.

Подождите и повторите попытку позже

. Если после завершения процесса «Обновить сейчас» проблема не устранена, попробуйте обновить свои аккаунты на следующий рабочий день. Эта ошибка может быть вызвана временным отключением или техническим обслуживанием сервера финансового учреждения, которое может быть устранено на следующий день.

Если проблема не устранена

Если после ожидания проблема не будет решена, вам потребуется определить тип подключения затронутых аккаунтов, чтобы определить, какие дальнейшие действия необходимо предпринять.Для этого перейдите в Инструменты > Список учетных записей , найдите затронутые учетные записи и подтвердите тип подключения в скобках в столбце Загрузить транзакцию .

• Direct Connect . Для решения этой проблемы вам необходимо связаться с вашим финансовым учреждением. У Quicken нет доступа к серверам финансового учреждения, чтобы решить проблему. Для этого вам может потребоваться обратиться к специалисту по онлайн-услугам, который решает проблемы с загрузкой транзакций в финансовом учреждении.  Если ваше финансовое учреждение заявляет, что не может помочь, может потребоваться эскалация в финансовом учреждении.  
• Express Web Connect . Обратитесь за помощью в службу поддержки Quicken.